以质粒为模板的pcr克隆线性化载体pcr不出来怎么办
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如题，质粒用的是从DH5α中提取出来的转化后的索来宝Pet-32a质粒。浓度为132ng/ml。现在想做同源重组，以质粒为模板做的载体线性化克隆pcr选取的酶切位点是ecor1和hind3。总共5900bp，用的vazyme p515 mix
50ul体系:
dd水 20.5ul
上下引物 （10um）2ul
质粒模板 0.5ul
mix 25ul
反应程序
预变性 95℃ 30s
变性 95℃ 15s
退火 58℃ 10s
延伸 72℃ 6min
彻底延伸 72℃ 5min
之后用dnp1 2ul37℃处理15分钟
有一次做温度梯度实验时10ul体系做的发现58℃有条带很暗但是单一正确。再做50ul体系进行胶回收发现一直扩增不出来结果如图所示。也不知道是什么原因。已经p了2个星期了。。。
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