融合蛋白选择linker的建议

什么是融合蛋白？其实每个做实验的同学都使用过只是你没有系统地将它归类而已。

融合蛋白：通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物，并且表达后这两个基因各自的抗原表位以及蛋白功能不变。大家在做实验的时候听过“带FLAG标签”、“带HIS标签”、“带GFP标记”吧？这些就是简单的融合蛋白。融合蛋白在分子生物学中的应用极为广泛，特别是在蛋白质的两端连上功能性小肽段标签，如FLAG、HIS、HA、MYC、E-TAG等（在公号上一篇文章里有具体讲到），用于WB检测或纯化。再复杂一些的应用，则是将需要目的蛋白与另一个较大的标记蛋白连接，常见的标记蛋白有GFP、mcherry、萤火虫荧光标签、海肾荧光标签等，可利用荧光蛋白对目的蛋白进行示踪和图像学分析，还有最复杂的就是两个功能互补或者需要研究功能互补的两个蛋白融合表达，像慢病毒的包装质粒，其需要表达的蛋白因子和病毒结构较多，又不能每段结构都设置启动子，于是融合表达就是改造载体的最好选择(红色标注为linker)。

还可以融合白蛋白或者或者将两个目的蛋白连接，用于延长目的蛋白的半衰期以及研究他们的共同功能或者相互作用。

想要做好分子生物学实验，了解一些必要的Linker知识，使我们在设计质粒方面更加得心应手。

根据蛋白质折叠特性，Linker分为3种，分别为柔性Linker、刚性Linker以及可剪切Linker。

最常见的柔性Linker，最简单的Linker就是基因与标签之间间隔的氨基酸（有部分人设计是不带linker的，通常对结构影响不大，但是部分蛋白由于离标签近的位置发生折叠，会导致两种肽段功能都受到影响），通常加两个甘氨酸作为linker，序列GGAGGG。

再长一点的linker就是常用的GS组合，就是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，通过改变n的大小，可以将结构域之间的距离放大和减小，实现结构域分离（n≥2）或连接结构域，这类liner可用于研究融合蛋白之间的相互作用，序列GGCGGTGGTGGCTCTGGTGGCGGTGGCTCC，这类序列设计出来，一定要进行密码子优化。

其他一些常见的蛋白Linker具有一些特定的用途，例如单链可变片段（single chainvariable fragment (scFv)）中，连接重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的柔性Linker，通常为KESGSVSSEQLAQFRSLD和 EGKSSGSGSESKST。这些序列中甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）提供柔软度，谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys）提高水溶性。

更简单粗暴一些的柔性Linker就是纯甘氨酸（Gly）组成的(Gly)8，或短一点点的(Gly)6，它们的优点是在酵母表达纯化过程中，能够抵抗蛋白酶的水解，同时保护两端蛋白结构域的功能活性。

具有(EAAAK)n序列的α-螺旋形成的Linker具有内部氢键和密切联系肽链骨干，刚性且稳定。因此，刚性α-螺旋Linker可作为蛋白质结构域之间的刚性间隔。通过将蓝色荧光蛋白（EBFP）和绿色荧光蛋白（EGFP）连接在一起，评估荧光共振能量转移（FRET）之间的效率，可以发现(EAAAK)n序列连接两个荧光蛋白时，荧光共振能量转移效率比(GGGGS)n序列低，说明α-螺旋Linker能够有效的隔离两个不同的蛋白结构域。

另一种类型的刚性Linker具有Pro-rich序列(XP)n，其中X可指定任何氨基酸，推荐选择丙氨酸（Ala），赖氨酸（Lys）或谷氨酸（Glu）。(XP)n序列没有螺旋结构，Linker中存在的脯氨酸（Pro）可以增加骨架硬度，并且有效分离结构域。富含脯氨酸序列的结构在机体中广泛的存在，例如骨骼肌蛋白的N端就存在(Ala-Pro)7的结构。

刚性Linker表现出相对坚硬的结构，能够有效的将两端的蛋白结构域分开，通过改变n的大小，就能够轻易调整结构域之间的最佳距离，从而保证两端蛋白的活性与生物功能。

到目前为止讨论的Linker通常不会在体内裂解。这些稳定的接头共价连接两个功能域，使得融合蛋白在体内变成一个蛋白。功能结构域之间的稳定连接提供许多优点，例如延长的血浆半衰期（例如白蛋白或Fc融合）。然而，它也有一些潜在的缺点，包括功能域之间的空间位阻，生物活性降低，以及由于域之间的干扰导致蛋白质部分的生物分布和代谢方式改变。在这些情况下，引入可剪切Linker，使得融合蛋白能够在体内释放，分离两个功能结构域。

一个研究的比较透彻的过程是二硫键的还原。这个可剪切Linker序列为LEAGCKNFFPR↓SFTSCGSLE，基于二硫环肽，在接头上的两个半胱氨酸（Cys）残基之间形成的分子内二硫键，同时这个序列对凝血酶敏感。在凝血酶的作用下能够有效的对Linker中凝血酶敏感序列（PRS）进行切割。

其他比较流行的可剪切Linker，能够不依赖蛋白酶，自行进行切割处理，使得两个结构域断裂。这类型有2A肽和IRES连接肽。

2A肽

2A肽（英语：2A self-cleaving peptides）是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。2A肽源自病毒基因组的2A区域[1][2]。这些自剪切Linker通为2A短肽，通常在序列NPG↓P进行自剪切分离。2A短肽通常来源于病毒的蛋白质序列，例如P2A表示来源于猪捷申病毒（porcine teschovirus-1）；E2A表示来源于马鼻炎病毒（equine rhinitis A virus）；F2A表示来源于口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus）。由于自剪切效率各有不同，2A短肽之间也存在一定差异，我们一般推荐使用P2A或T2A序列。

随着对天然多结构域蛋白中的Linker和重组融合蛋白的广泛研究，研究者们萌生了构建数据库的想法，提出了Linker设计工具，基于融合蛋白的期望特性来合理设计Linker。这种类型的工具的一个典型例子是名为synlinker的程序，该程序在用户指定的输入（例如Linker长度，要避免的蛋白酶敏感序列）中搜索其连接子序列的数据库，并生成几个连接子序列的输出。Linker数据库是基于这样的假设建立的，即在X射线晶体结构或NMR溶液结构中观察到的环序列可能采用延伸构象作为融合蛋白中的Linker。最终的数据库包含14,734个序列，它们包含PDB文件中的记录，可自动识别蛋白质的二级和环状结构。程序的基本输入是Linker序列的期望长度，通常表示为残基数量或以埃为单位的距离。额外的输入参数包括，避免被蛋白酶或限制性内切酶切割，使得选择的Linker在克隆过程中对特定蛋白酶稳定或序列对限制性内切酶具有抗性。使用者还可以加入氨基酸组成偏好（例如，消除疏水性残基）以进一步选择其感兴趣的Linker。此程序可以作为生成Linker序列的工具，使用十分便利（http://synlinker.syncti.org/）。

描述：2A肽诱导的肽剪切发生在转译完成之后。2A肽C端脯氨酸（P）和谷氨酸（G）之间的肽键发生断裂，使多肽剪切为两段。2A肽诱导的剪切效率较高，部分情况下，剪切效率可以达到接近100%。现有证据支持转译时2A肽会诱使核糖体在合成至2A肽中断裂处的谷氨酸时，提早将前半段已合成的肽链放出，从而以2A肽为界形成二段多肽[4][5]，但目前尚不完全清楚这一过程具体的分子机制[6][7]。

应用：在基因工程中，2A肽可令一个开放读框（ORF）转译出的肽链分为数个独立的肽链。如果需要令两个蛋白分开表达（例如需要一个蛋白进入细胞核、另一个蛋白在细胞质中表达），又希望只在载体上构建一个开放读框，可在它们的编码区中插入一段2A肽序列。除此之外，如果两个蛋白融合后，融合蛋白没有功能，可以在两个蛋白的编码区中间插入一段编码2A肽的序列，或将连结肽更换为2A肽，使转译完成后两个蛋白分开，独立进行折叠。这样做有很大机会使两个蛋白恢复功能[8]。

IRES

人们发现，虽然一般真核mRNA的翻译都需要5’帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。同样可以从一个开放读框翻译出两个肽链[9]，但其特性略有不同：由IRES分隔的两段肽链虽在同一个转录本上，但因它们各自独立转译，合成的肽链不会包含IRES序列；另外在IRES上游的肽链表现效率高于位在下游的肽链[10]。相对而言，2A肽本身的序列在剪切后仍然分别存在于上下游的二个产物肽链，在表现效率上，2A肽链上下游的肽链表现量相近[10]。搭配使用2A肽与IRES或是使用多个2A肽均可以在一个开放读框中表达多个重组蛋白[11]。

内部核糖体进入位点（IRES）是天然存在于一系列mRNA中的翻译增强子，当存在于目的基因之间时介导翻译的内部起始。因此，IRES可以通过设计类似于细菌操纵子的多顺反子表达盒，驱动由相同mRNA编码的几个基因的翻译。处在IRES元件前后的两个基因相对独立,可以表达得到完整的目的蛋白。但由于IRES的结构较大,其应用常受到载体容量的限制,并且IRES对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱。

标签要根据实验目的进行选择，了解一些linker知识就算你让公司合成载体也不至于一脸迷茫哟！

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