人外周血Th1/2/17检测标准流程
Part 1 背景知识
效应CD4+T细胞以往被认为只是由Th1或Th2组成，现在认识到还有Th9、Th17和Th22。这些细胞的区别在于它们分泌的细胞因子：
Th1细胞分泌IFN-γ；Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13；Th9细胞分泌IL-9；Th17细胞分泌IL-17；Th22细胞分泌IL-22。需要说明的是，以上因子并非这些细胞分泌的所有因子，而是其中几个最有特征性的。
Th1辅助细胞主要为对抗细胞内细菌及原虫的免疫反应，其主要为白介素12(IL-12)所驱动诱发，其主要的执行的细胞因子是伽马干扰素(IFN-γ)，其最重要的执行细胞为巨噬细胞(Macrophage)另外还有杀手CD8+T细胞、产生IgG的B细胞以及分泌IFNg的CD4+ T细胞等、其主要的转录因子为STAT4 另外还有T-bet等等 。CD4+T细胞分泌的IFNg会活化巨噬细胞，使其能够吞噬并消化掉细胞内细菌及原虫，另外IFNg也会活化iNOS而放出NOx等自由基而直接杀死细胞内细菌及原虫，TH1免疫反应对应的是第四型自体免疫疾病(Type4 delayed type hypersensitivity)也就是过分的TH1激活将会导致巨噬细胞自体免疫疾病比如麻风病或结核菌素过分反应或第一型糖尿病等都属此类。主要功能是增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，特别是抗胞内病原体的感染。IFN-γ（γ干扰素）活化巨噬细胞，增强其杀伤已被吞噬的病原体的能力。还能促进IgG的生成。
辅助型T细胞2(T helper 2 cell，Th2)是一种能够分泌Th2型细胞因子(如白细胞介素IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等)的T细胞亚群，属于CD4+T细胞。这些细胞因子能够促进Th2细胞增殖，并抑制Th1细胞增殖，同时辅助B细胞活化，发挥体液免疫的作用。
主要功能是：
1、辅助B细胞活化，Th2细胞的主要效应是辅助B细胞活化，其分泌的细胞因子可以促进B细胞增殖、分化和抗体的生成。
2、诱导过敏反应，在I型超敏反应中，变应原进入机体后被树突状细胞(DC)所捕获，并将其提呈给Th0细胞。随后Th0细胞识别抗原而活化并分化为Th2细胞，从而产生多种Th2型细胞因子。 [2] IL-4能够促进B细胞活化而产生免疫球蛋白IgE。IgE可以与抗原以及嗜碱性粒细胞或肥大细胞表面的IgEFc受体(FcεR I)相结合，而使其活化。活化的嗜碱性细胞和肥大细胞会合成并释放多种炎症因子，包括细胞因子(IL-1、TNF-α)、组胺、肝素、血清素、前列腺素、白三烯和激肽原酶等。这些炎症因子的作用包括导致支气管收缩、血管扩张、血管通透性增强和炎症细胞的聚集，从而产生过敏症状。同时，IL-5和IL-9分别可促进嗜酸性粒细胞增生和肥大细胞的增殖。而IL-13则能促进杯状细胞产生黏液并增强气道反应性，导致过敏性哮喘。
3、抗寄生虫感染，肠道内的寄生虫也能够引发Th2细胞的活化，并激活多种免疫细胞和非免疫细胞来清除肠道寄生虫。IL-4和IL-13能够促进肠道杯状细胞增殖并改变黏液组成，产生更多的可溶性黏蛋白。同时IL-13还可诱导肠道上皮细胞的更新增加并增加肠道通透性和平滑肌收缩性。这些变化使得肠道蠕动和排便增加，从而使机体能够排出寄生虫。而IL-5会在肠道内募集并活化嗜酸性粒细胞，使其能够对肠道寄生虫进行攻击。
由于Th1细胞和Th2细胞都能分泌细胞因子促进自身的增殖并抑制对方的增殖，因此在正常情况下机体中 Th1细胞和Th2细胞处于相对平衡的状态。但当机体发生功能异常时，常表现出平衡偏向其中一方，称为 “Th1/Th2漂移”。一旦Th1细胞和Th2细胞之间的平衡状态被打破，很可能造成人体细胞因子网络的动态平衡被破坏，进而引起许多疾病的产生和发展。
许多肿瘤，包括肺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌等患者的机体内均存在Th1/Th2平衡漂移，常常Th2细胞占优势状态，可能肿瘤的免疫逃逸有关。
而在一些自身免疫性疾病中，不同的疾病表现出的Th1/Th2平衡漂移各不相同。如类风湿性关节炎、I型糖尿病、多发性硬化及慢性甲状腺炎等疾病中，Th1占优势状态；而在系统性红斑狼疮、硬皮病以及一些常见的变态反应性疾病中，则Th2占优势状态。
由于Th1/Th2平衡漂移与多种各种疾病存在关系，越来越多的研究正倾向于发现、开发能逆转或稳定Th1/Th2 平衡的药物和方法。如应用细胞因子或细胞因子拮抗剂逆转Th1/Th2平衡漂移以治疗肿瘤及其他疾病：Th1型细胞因子可以促使Th1/Th2平衡向Th1状态转化，而抑制 Th2 优势表达；而 Th2型细胞因子则起相反作用。
效应CD4+T细胞以往被认为只是由Th1或Th2组成，现在认识到还有Th9、Th17和Th22。这些细胞的区别在于它们分泌的细胞因子：
Th1细胞分泌IFN-γ；Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13；Th9细胞分泌IL-9；Th17细胞分泌IL-17；Th22细胞分泌IL-22。需要说明的是，以上因子并非这些细胞分泌的所有因子，而是其中几个最有特征性的。
Th17是一群独特的活化辅助T细胞亚群，通常在上皮和粘膜屏障中提供抗微生物免疫功能，它们也在一些自身免疫疾病中起着重要作用。
Th17的特征是胞内 RORγt 和STAT3的表达，以及细胞因子 IL-17A, IL-17F, IL-21和 IL-22的表达，而表面标记主要有：CD4、CD161、CCR6等。
分泌细胞因子的免疫细胞在适应性免疫中起着中心作用，对这些细胞进行定量，有助于理解免疫反应。Th1和/或Th17细胞在一些疾病发病过程中有着重要作用，例如炎症性肠病、类风湿性关节炎和多发性结节性硬化等。对Th1和Th17细胞的定量，可为这些疾病和其它Th1和/或Th17相关疾病的研究提供重要信息。
有研究显示在同种异体自然怀孕中，Th17和局部炎症反应可发生在母胎界面，蜕膜内的NK细胞中CD56brightCD27+NK亚群通过IFN-γ抑制Th17细胞而促进免疫耐受及后续顺利的怀孕。而在习惯性自发流产患者中，NK细胞失去了该调节反应。
流式细胞术检测人外周血Th1、Th17细胞有两种主要方法，一种主要是根据细胞表面标记，如CXCR3、CCR6、CD161，比较节省时间，但这些标记不是Th1、Th17特异性的，故容易导致比例增多，另一种则根据表面和胞内染色，通过体外培养刺激，促进细胞分泌细胞因子。
Th17产生IL-17A/F、IL-21、IL-22、IL-26、GM-CSF和TNF-α。IL-1β、IL-6、IL-23和TGF-β，在不存在1型干扰素、IFN-γ和IL-4的情况下，可促进Th17分化：
Th17细胞的大部分效应能力来自IL-17和GM-CSF的产生。 IL-17与TNF-α一起通过诱导粘附分子、促炎细胞因子（包括IL-6、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子[G-CSF]）、趋化因子、前列腺素E2和基质金属蛋白酶的表达强烈促进炎症。IL-21调节B细胞、T细胞和NK细胞功能，在B细胞中，已发现IL-21调节浆细胞分化并促进IgM和IgG1抗体的产生，IL-21是T细胞生长因子，并且在TCR信号存在下，IL-21促进T细胞活化、增殖和存活。因此，似乎Th17细胞对于效应细胞的募集很重要，包括中性粒细胞和单核细胞。
Th17细胞响应于细胞外细菌和真菌的感染。已在患有特应性皮炎、克罗恩病、牛皮癣和多发性硬化症的患者中发现增高的Th17细胞。实验模型证明，Th17细胞通过产生GM-CSF和IL-17致病，是自身免疫性疾病（如实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE））的重要致病因素。 IL-17表达受损或诱导Th17分化功能区发生突变，可使患者出现金黄色葡萄球菌和白色念珠菌反复感染。已经发现IL-23R的等位基因对克罗恩病和牛皮癣有一定的保护或易感作用。目前正在进行临床试验，以验证自身免疫性疾病患者中Th17免疫应答的破坏效应。 IL12/23 p40、IL23 p19和IL-17a的单抗已被批准用于治疗牛皮癣和其它自身免疫性疾病。
Part 2 检测流程
检测步骤：
1. 往刺激管DuraActive Tube1（贝克曼库尔特，C11101）里加入50μl肝素钠抗凝全血，混匀后在二氧化碳培养箱培养4h；
2. 培养好的刺激管加入25μl 缓冲液1（即固定剂，Perfix-NC，B31167），立即涡旋振荡混匀，室温避光孵育15min；
3. 加入300μl 缓冲液2（即破膜剂，破膜剂Perfix-NC，B31167），涡旋振荡混匀，立即加入20μl IFN gamma-FITC、20μl IL-4(4D9)PE、10μl IL-17A-PB、10μl CD4-APC、10μl CD3-APC-A750、10μl CD45-KO，混匀避光孵育40min；
4. 加入3ml 1×稀释液（将10×溶液稀释为1×溶液）混匀，500g离心5min，弃上清；
5. 加入500μl1×稀释液混匀上机。
