人外周血Treg/Th17检测标准流程

准备工作：

Ø 采用肝素钠抗凝管采集外周血3~5mL，采集后的外周血须在6h内分离完淋巴细胞；

Ø 将实验用所需耗材（如移液器、离心管、巴氏管、24孔板、Tip头等）放入超净台，灭菌30分钟后待用；

Ø 将淋巴细胞分离液、生理盐水、1640培养基、刺激剂、胎牛血清从冰箱中取出平衡至室温（如将此类耗材放入超净工作台不得开启紫外灭菌模式）；

淋巴细胞分离：

Ø 血液准备：然后每个样本各取3根15mL无菌离心管，分别标记为1号、2号、3号管（备注：其中1号管用于血液样本稀释，2号管用于淋巴细胞分离，3号管用于分离后的淋巴细胞洗涤）；

Ø 将各个血液样本分别倒入1号离心管，按照等体积稀释（人外周血一般采用4mL外周血加入4mL生理盐水），混匀备用；

Ø 在各个样本的2号离心管底部加入4mL分离液，将稀释后的血液样本小心铺在分离液上面，室温800g离心30min（或1000g离心20min，如有带刹车功能的离心机，须先把刹车功能关掉，原则上采用升速快降速慢的离心机）；

Ø 离心后可见液体由上至下清晰地分成4层，第一层为血浆层，第二层为分离液层，第三层为单个核细胞层，第四层为红细胞层。

Ø 用巴氏管升入离心管直接吸取白膜层细胞（即第三层单个核细胞层）到3号离心管中，加入5~7mL左右的PBS或者无血清培养基重悬细胞，350~500g离心5min后弃上清，重复此步骤1次；

Ø 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基完全培养基重悬细胞沉淀，用细胞计数板计数；

Ø 配置完全培养基，1640培养基：FBS：Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A) 500×=9：1：0.02，即每10mL完全培养基中含9mL 1640培养基，1mL FBS，20μL Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A)。

Ø 用完全培养基稀释细胞密度到1×10⁷cells/mL。（一般来说正常人1mL外周血能获得不少于1×10⁶个淋巴细胞，因此4mL外周血分离后的淋巴细胞直接1~2mL稀释即可。）

Ø 取1mL细胞悬液到24孔板中，做好标记，然后将培养板放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱培养6-8h（不得少于6h）；

Ø 从细胞培养箱中取出细胞培养板并收集体外刺激培养的细胞，350g离心5min后弃上清；

以下步骤可在有菌环境中操作，不影响实验效果。

抗体标记：

Ø 准备流式上样管，并做好相应的标记。

Ø 用3~5mL PBS重悬细胞，350g离心5min后弃上清，重复2~3遍，然后采用100μL的Cell Staining Buffer（可用生理盐水或PBS代替）重悬细胞。

Ø 按照管设置分别加入相应的表面标记抗体（先按照样本数量对表面抗体进行预混，然后按量加，如本方案中的FITC anti-human CD3、APC anti-human CD4、PE anti-human CD25各5μL），混匀后，室温避光孵育15-20min。

Ø 加入至少2mL的PBS洗1次，350g离心，5 min，弃上清。

Ø 将Fixation/Permeabilization Concentrate（4×）和Fixation/Permeabilization Diluent按照1:3比例混合制备成1×工作液，每个样本需要1mL，即配即用。

Ø 加入Fixation/Permeabilization工作液固定细胞，室温避光孵育固定45~60min（建议不低于45min，以60min最佳，每次实验采用同一个时间即可）。

Ø 用去离子水将10×的Permeabilization Wash Buffer 稀释成1×的工作液。

Ø 将孵育后的样本350g，离心，5min，弃上清，不洗涤。

Ø 用2mL 1×的Permeabilization Wash Buffer重悬固定的细胞，350g离心5-10 min，弃上清（如遇室温低的情况，可静置1~3min后再离心），重复该步骤两次。

Ø 用100µL Permeabilization Wash Buffer 重悬固定破膜后的细胞（通常情况下残留液体已足够），加入特定的荧光标记抗体（将所需的胞内核内抗体预混后再加，即本方案中的PE-Cy7 anti-human IL-17A、BV421 anti-human FoxP3各5μL），室温避光30min。

Ø 用 2mL Permeabilization Wash Buffer重悬细胞，350g离心5 min，弃上清。重复步骤2~3次；

Ø 加入200-300μL的Cell Staining Buffer重悬细胞。

Ø 上流式分析。

PS：CD25的克隆号建议选M-A251，BC96的克隆号和FoxP3搭配双阳不明显。有需要做类似实验的老师可以联系我哦。