protocol 分享｜开课啦~手把手教你流式细胞仪检测细胞周期
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简介
流式细胞仪（flow cytometer，FCM）又称荧光激活细胞分类仪（fluorescence activ-ited cell sortor，FACS），由光学系统、电子控制系统以及计算机分析系统三个部分组成。
原理
流式细胞仪检测细胞周期的基本原理是荧光素标记的细胞或生物微粒从50～100 μm的喷嘴中逐个高速喷出，由激光光源激发荧光，通过荧光检测器和前向散射检测器分别检测荧光和散射光，经计算机分析和处理获得的信息参数（见图7-1）。
可用于细胞计数、不同细胞类型的计数和分选、细胞周期测定等，尤其该仪器的分选过程可以在无菌条件下进行，因此所分选得到的细胞不仅可保持它们的活性，而且可继续在体外培养与增殖。
流式细胞仪检测细胞周期的原理是根据细胞在不同的细胞周期时相中DNA含量存在差异的特点，应用DNA荧光染料染色，检测细胞内DNA荧光强度变化，判断细胞所处的细胞周期（见图7-2、图7-3）。
常用碘化内锭（PI）作为染料。PI为核酸嵌入型染料，可以插入双股螺旋多聚核苷酸结构中，导致DNA和RNA着色。
用途
流式细胞仪细胞生物学、免疫学、肿瘤生物学、病理学以及临床诊断中得到广泛应用。
材料与仪器
器材：
移液器；枪头；离心管；离心机；流式细胞仪；水浴锅。
试剂：
①0.25％ 胰蛋白酶溶液；
②PBS；
③RNA酶；
④PI染液；
⑤70％ 乙醇溶液；
⑥PI染液：15 mg Pl；枸橼酸钠0.1 g；NP-40,0.3 ml；加蒸馏水至100 ml。
步骤
流式细胞仪检测细胞周期的基本过程可分为如下几步：
A. 取培养细胞1瓶，用胰蛋白酶消化，用PBS制备成细胞悬液。
B. 1000 g离心10 min，弃上清液。加入70％ 乙醇固定液重悬细胞，固定30 min。
C. 1000 g离心10 min后，用PBS离心洗涤2次。
D. 离心后，用RNA酶消化细胞，室温30 min。
E. 重复步骤（3）。
F. 用PI染料处理细胞20 min。
G. 同步骤C用PBS洗涤细胞。
H. 在流式细胞仪488 nm激发波长下测定。
注意事项
1. PI为致癌物质，避免用手直接接触。
2. 细胞数目应该达到2x104个，细胞数目过少影响实验结果的准确性。
3. 在制备时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失。
4. 以正常淋巴细胞调试流式细胞仪。
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最后编辑于 2022-08-03 · 浏览 4333
