MC综述：肿瘤缺氧微环境中的外泌体

今天给大家介绍2022年新发表在Molecular Cancer上的一篇关于肿瘤缺氧微环境中外泌体的综述，描述外泌体在肿瘤缺氧微环境中释放、摄取、生物功能以及面临的临床应用。

背景

缺氧是肿瘤微环境的一个显著特征，是很多实体肿瘤的一种标志。肿瘤缺氧是由于癌细胞与血管之间的距离超过了氧扩散的极限。肿瘤中没有明确的常氧区和缺氧区的界限，但一般可将肿瘤组织分为三种区域：常氧区【附近有功能血管】、缺氧区【离功能血管约100 μm，氧分压为<10 mmHg】、坏死区【离血管约150 μm，氧浓度极低】。

在整个癌症发展过程中，缺氧可能产生不同的影响。特别是它可以刺激血管生成，致使癌细胞恶性增殖、抑制细胞凋亡、免疫逃避等；最终导致更加恶性和致命的癌症。缺氧肿瘤微环境中细胞通讯更加频繁和复杂，越来越多的证据表明，细胞外囊泡（EVs）通过作为信号转运蛋白参与复杂的缺氧过程。

EVs被定义为具有脂质双层膜的粒子，该膜含有供体细胞的成分，但缺乏功能核。所有细胞均能释放细胞外囊泡，它们携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物，是健康和疾病中近距离和长距离细胞间通讯的媒介，影响细胞生物学的各个方面。细胞外囊泡在生理和病理过程中的作用是毫无疑问的，不同类型的细胞外囊泡显示出重叠的生物物理特性，缺乏可以完美区分亚型的特定标记，目前大致可以分为两种类型——微囊泡和外泌体(Fig.1)。本篇综述中，作者主要关注外泌体。

微囊泡是通过细胞质膜出芽释放的，其直径大约为100-1000nm，文献中通常将这部分称为microvesicles或ectosomes；外泌体则由多泡体（MVBs）内部产生，与质膜融合分泌而成，其直径一般在40-160nm之间。【MVBs由早期分选内体 (ESEs) 演化而来的晚期分选内体 (LSEs) 产生，是第一次内陷的产物；MVBs可通过第二次内陷后与质膜融合，释放腔内囊泡（ILVs，preexosomes）作为外泌体，或者与溶酶体和自噬体融合并被降解】

Fig.1 细胞外囊泡和外泌体的同一性和异质性

Ref：The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020

与缺氧类似，外泌体也参与各种生理和病理过程，在这些过程中，它们主要作为重要的信使。因此在癌症中，缺氧与外泌体之间可能存在一定的内在联系，本文将对这些关系进行综述。

章节一：缺氧可影响外泌体的释放

癌症相关细胞比健康细胞分泌更多的外泌体，因为细胞间需要交换信息或营养物质。据估计，癌症患者血液中含有的外泌体数量是健康人类血液中的两倍。有理由认为，由于肿瘤形成的复杂缺氧环境，肿瘤中，需要更多的外泌体来满足细胞间的通信需求。

这种情况已在各种癌症中得到证实，如胶质瘤、乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌(CRC)和前列腺癌。有趣的是，与缺氧相比，高氧可以减少CRC中释放的外泌体数量。这表明，缺氧通过增加癌细胞外泌体的数量对肿瘤产生影响，外泌体可以将信号传递给受体细胞。同时，缺氧还会导致非癌细胞外泌体数量的增加，这表明缺氧导致外泌体数量的增加具有普遍性，而非只发生在癌细胞中。

货物分拣、多泡体的运输和与质膜的融合是外泌体释放的关键步骤，缺氧可能会影响这些步骤。货物和货物分拣机制是外泌体释放的第一个调节因子，缺氧可能介导它们的活性。双免疫荧光分析证实了这一点，sRAB22A富集在微囊泡(MVs)膜中，这表明RAB22A是MV货物，在缺氧条件下，RAB22A的HIF依赖性过表达被证明是MVs形成增加的必要条件。尽管 MVs 与外泌体不同，但该研究为外泌体货物的缺氧调节提供了一些见解，这会影响外泌体的释放。

外泌体marker，例如某些四跨膜蛋白（CD81 和 CD63）和 TSG101，也是缺氧调节的良好指标。其中一些marker既是外泌体货物又是分拣介质。例如，CD63 在外泌体表面特别富集，据报道在黑素生成过程中的内体分选中起作用；四跨膜蛋白 CD81、CD82 和CD9直接参与将各种货物分选为外泌体；四倍铁蛋白在缺氧时上调。这些研究间接支持了缺氧暴露可能影响货物装载和随后外泌体释放的观点。

胞内运输涉及细胞器与细胞骨架(肌动蛋白和微管)以及相关的分子马达(动力蛋白、动蛋白和肌球蛋白)和分子开关(小GTPases)的联系。缺氧条件下，肌动蛋白细胞骨架、微管和分子马达被认为在不同的细胞中发生变化。一个可能的例子是侵袭性伪足（invadopodia）、侵袭性肌动蛋白结构（invasive actin structures）和外泌体的关键分泌位点。有证据表明，缺氧可促进侵袭性伪足的形成。此外，如上所述，MVBs与溶酶体融合，导致降解，或与质膜融合，导致 ILVs作为外泌体释放。当这两条通路中的一条被阻断时，MVBs 将进入另一条通路。

尽管多泡内体 (MVEs) 降解和分泌之间平衡的调节在很大程度上仍未探索，但可以解释缺氧如何增加该系统中外泌体的释放——缺氧可以通过阻断降解途径参与MVEs的细胞内转运，为MVEs与质膜的融合铺平道路，增加癌症中外泌体的释放；但是这还需要进一步验证。此外，低pH和酸性微环境明显是缺氧的结果，这些特征有利于外泌体的释放和吸收。另一个间接例子是缺氧通过MCT1和CD147以钙依赖性方式诱导外泌体释放。然而，在上述缺氧的直接和间接影响中，哪一个是最重要的还有待观察。

在此基础上，作者认为缺氧通过影响许多关键和辅助因素，参与了外泌体释放和MVBs降解的过程。然而，缺氧如何影响或与这些关键分子相互作用仍不清楚。翻译起始、延伸或终止的抑制、适应性蛋白质的合成、广泛的蛋白质修饰和代谢重编程是主要的缺氧相关调节机制，这些机制已被 Lee 等人广泛综述 (Fig.2) 。

Fig2. 蛋白酶稳态中的缺氧适应

Ref：Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;

此外，生物功能由一个网络操纵，该网络受与premRNA转录物转录后加工相关的因素影响，包括可变剪接；mRNA产物的稳定化或降解；mRNA翻译的调节；蛋白质产物的翻译后修饰、稳定或降解。在转录水平上，缺氧主调节因子 HIF（一种转录因子）的过表达始终与缺氧癌细胞中外泌体释放的增加有关。例如，PKM2 的 mRNA 表达以 HIF-1 依赖性方式因缺氧而增加。在蛋白质修饰方面，除ISGylation，磷酸化也会影响外泌体的生物发生。ncRNA可能是缺氧和外泌体释放之间的另一种潜在媒介。一个很好的例子是 lncRNA HOTAIR，它具有促进肝细胞癌中外泌体分泌的能力，并且在几个细胞系的缺氧条件下上调(Fig.3)。

Fig3. HOTAIR在外泌体分泌调节中的作用模型

Ref：Long non-coding RNA HOTAIR promotes exosome secretion by regulating RAB35 and SNAP23 in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer. 2019

章节二：缺氧可提高肿瘤外泌体异质性

外泌体群体的异质性是细胞状态的反映，外泌体群体由大小不同的外泌体、内外不同的载体、对受体细胞不同的功能影响和不同的细胞来源组成，这使得外泌体成为潜在的诊断和预后工具。例如，最近的一项研究通过使用合成探针检测药物占用情况，成功地评估了药物的效力。不同细胞释放的外泌体含有不同的物质和标记物，来自同一细胞系的外泌体可以携带不同的成分。因此，异质性不仅是外泌体应用的前景，还是理解外泌体的障碍之一。

在这篇文章中，作者重点研究了与外泌体行为复杂性增加相关的缺氧，并指出了外泌体生物发生、货物装载、释放、运输、与靶细胞结合、摄取和最终生物功能的时间顺序；特别指出了外泌体在运输后暴露于缺氧所导致的生物功能变化，绑定和吸收。

一、缺氧改变TME中外泌体的大小

外泌体的大小甚至在单个细胞系中也有显著差异，这可能是由于外泌体生物发生过程中限制膜内在的不均匀内陷，有报道称外泌体的大小与某些疾病有关。有许多问题阻碍了研究者们对外泌体大小的理解。但缺氧增加了这种模糊性，缺氧环境下，往往会导致释放更小的外泌体。对各种癌细胞及癌症相关的细胞株，如结肠癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞和骨髓间充质干细胞等实验证实了这一倾向。

二、缺氧影响癌症外泌体的货物分类机制

外泌体物质(蛋白质、核酸、糖缀合物和脂类)及其相应的功能已被详细研究。与外泌体大小相似，外泌体货物表现出异质性，在不同癌症驱动的外泌体中差异很大，并且因缺氧而富集。

1. 蛋白质

在外泌体蛋白的异质性方面，据报道，在单个细胞系释放的3个外泌体样品中检测到3000多种常见蛋白和1000多种独特蛋白。基于在质膜和内体膜上均产生外泌体的事实，有限的承载能力和空间排斥是异质性的最初原因。蛋白质分布、基因表达和环境因素的差异增加了这种多样性。作者认为，选择性负载是异质性的另一个不可忽视的原因，因为外泌体蛋白含量并不总是与细胞蛋白的比例一致。

一项研究中，与常氧组相比，缺氧组的细胞外泌体蛋白有130个上调和129个下调，表明缺氧增强了外泌体的异质性。鉴于此证据及其他研究，缺氧通过改变外泌体蛋白的异质性，促进了癌症细胞的许多恶性表型，而且癌症源性外泌体中的蛋白有时有助于缺氧反应。

缺氧外泌体（HypoExos）中增加蛋白质异质性的关键机制已经慢慢确定，根据目前研究，作者总结缺氧环境下外泌体蛋白质异质性的潜在可能。首先，最简单的可能性是癌细胞中蛋白质越多，表明外泌体中蛋白质越多。在给定的细胞类型中，当特定蛋白质的数量增加时，它们会占据更多空间；因此，推测在外泌体形成过程中将包括更多的蛋白质。同样，具有较少蛋白质的外泌体来源于蛋白质表达降低的细胞。缺氧可以通过刺激复合物的形成来促进蛋白质合成，该复合物包括 HIF-2α、RNA 结合基序蛋白4 (RBM4) 和 eIF4E2（一种 eIF4E 同源物），这些复合物在反向缺氧反应元件 (rHREs) 处组装并形成缺氧-特异性 eIF4F 复合物，结合 rHREs 以促进翻译起始或通过各种机制抑制某些蛋白质的产生，例如通过抑制翻译(Fig.2)。

然而，细胞中存在更多蛋白质并不是总是表明存在更多外泌体蛋白，因为蛋白质分选机制可能会影响外泌体蛋白的数量。因此，缺氧可能会影响与蛋白质负载相关的关键分子，从而影响外泌体蛋白的数量和类型。另外，缺氧可以通过影响泛素化来影响癌细胞外泌体的蛋白质装载过程。除了这些特征外，外泌体内膜富含分子伴侣，与聚集和错误折叠的蛋白质结合，缺氧会导致错误折叠的蛋白质积累。

2、核酸

目前，大多数研究人员认为外泌体包含多种核酸，包括RNA (mRNA和ncRNA：lncRNA、snRNA、miRNA、tRNA、Y RNA、vault RNA、重复元件RNA和片段RNA)和DNA序列(DNA、单链DNA、双链DNA、基因组DNA、线粒体DNA和逆转录互补DNA)。

很少有文章报道缺氧对肿瘤细胞来源的外泌体DNA的影响。然而，缺氧对癌细胞外泌体RNA的影响已被广泛报道。缺氧如何在RNA生物发生中发挥作用的网络是复杂的，涉及许多分子。从货物方面来看，缺氧可以调控不同ncRNA类的表达，在某些情况下，这些ncRNA可以影响HIF的表达和稳定性，形成正负反馈回路。HIF-1α和/或HIF-2α可以直接靶向RNA元件。其他与HIF无关的因素，抑制某些特定的肿瘤抑制类miRNAs对缺氧应激的反应。

缺氧也会影响RNA的选择性剪接和RNA编辑。这些效应可能使特异性RNA更适合在癌细胞来源的外泌体中负载。除了影响与运载物相关的因素，缺氧还可能影响癌细胞将核酸装载到外泌体的工具，包括RNA结合蛋白。

3、糖缀合物和脂质

三种主要的代谢途径(糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢)和核苷酸代谢对哺乳动物是必不可少的，并在缺氧癌细胞中被重新编程。即使在常氧状态下，癌细胞也会经历糖代谢的重新编程，因为三羧酸循环被有氧糖酵解所取代，这被称为“瓦伯格效应”。

外泌体与细胞具有相同的拓扑结构。外泌体膜上存在着含有不同模块的异质糖缀合物。然而，外泌体和细胞之间的相似性表明，缺氧可能影响癌细胞内的外泌体糖缀合。一，细胞膜上的糖缀合物在细胞间和细胞环境间的通信中发挥着重要的作用，外泌体是细胞间重要的信使。二，癌细胞来源的外泌体的糖缀合特征与健康细胞不同，这意味着外泌体的糖缀合是异质性和可变的。三，缺氧会影响细胞膜上糖蛋白的表达。此外，糖缀合物在蛋白质分类和摄取方面具有上述作用，缺氧细胞以蛋白糖依赖的方式摄取更多的外泌体。

总而言之，在装货之前，货物必须生产出来；随后，货物被标记、识别并随细胞骨架运送到特殊的细胞间位置，在那里许多关键分子促进其内在化成为MVBs，这些货物最终驻留在MVBs释放的外泌体中。虽然各种癌细胞缺氧作用的细节各不相同或仍不清楚，但缺氧影响货物的数量、种类和状态，并通过分类机制，缺氧可以影响癌细胞装载货物。探索缺氧癌细胞外泌体负载的具体机制将极大地促进外泌体的发展，外泌体可用于靶向缺氧TME，以更好地治疗癌症。

章节三：缺氧下外泌体的细胞外运输、结合和摄取

外泌体运输是指释放和吸收之间的中间过程。缺氧会增加外泌体的数量，而且这些外泌体大部分在血液中传播。外泌体大小的变化影响运输的观点是可信的，酸性环境最适合外泌体的存在和隔离。这表明，短距离外泌体运输可能受益于缺氧和酸性微环境。

1. 在翻译水平上，缺氧影响货物合成。
2. 缺氧影响外泌体释放和货物装载关键工具(如YBX1和hnRNPA1)的货物分拣。
3. 缺氧阻止MVBs降解，增加外泌体释放(如下调Rab7)。
4. 缺氧导致MVBs向质膜转运的关键分子过表达，从而增加外泌体释放(如Rab27)。
5. 缺氧可能通过促进MVBs和质膜(如SNARE蛋白)的融合来增加外泌体的释放。
6. 细胞间转运包括通过循环系统向远处受体细胞的长距离运输和局部TME中的短距离运输。缺氧诱导的较小的外泌体似乎有利于循环运输，但尚未得到证实。酸性微环境是缺氧的结果，在局部酸性微环境下可能有利于运输缺氧和低pH可提高外泌体吸收效率。
7. 在低pH条件下，膜组成的改变会影响同源细胞对外泌体的吸收(Fig.4)。

Fig.4 缺氧影响外泌体的生物过程和关键步骤的示意图

章节四：外泌体介导的肿瘤缺氧生物功能

著名的癌症研究领导者Hanahan和Weinberg总结了癌细胞的获得能力，并随着癌症研究的进展，发现了其他的标志和致癌因子(微生物群、肥胖和自噬)。来自癌细胞或癌症相关细胞的外泌体可以介导许多生物功能，而缺氧强化了这些生物功能(Fig. 5)。

1. 增殖、凋亡和生长抑制

自给自足的生长信号、下调的抗生长因子和凋亡减少导致细胞快速繁殖。肿瘤增殖通常由HypoExo载体促进，缺氧下肿瘤细胞的凋亡通常由外泌体抑制。

2、无限复制

无限复制潜能为癌细胞增殖提供了无限的来源，并与端粒和衰老密切相关。含端粒重复的RNA(TERRA)可以保护短端粒以维持细胞有丝分裂，TERRA存在于人类淋巴母细胞释放的外泌体中，具有促炎作用。

3、血管生成，侵袭和转移

血管生成是一个在满足营养物质和氧气需求的情况下，代谢废物和二氧化碳的过程，而侵袭和转移是癌症相关死亡的主要原因。先前的研究证实缺氧诱导血管生成，评估了外泌体在缺氧诱导的肿瘤血管生成中的作用。例如，来自高恶性胶质母细胞瘤多形性细胞的HypoExos通过刺激内皮细胞分泌细胞因子和生长因子诱导血管生成，从而促进周细胞迁移。然而，肿瘤转移是一个多步骤的过程，称为侵袭转移级联反应。因此，我们应该进一步探索从原代肿瘤细胞发育到转移形成的每一个步骤中外泌体的作用。

4、免疫应答

由于检查点阻断的成功，免疫疗法已成为一种成熟的癌症治疗方式。逆转免疫抑制和促进免疫活性是免疫治疗的两大主要策略，而信号通路和代谢重编程是免疫相关配体受体结合诱导的免疫应答的两大主要调节因子。在这里，我们首先关注信号通路，以PD-1/PD-L1为例对配体和受体进行分析。在信号抑制方面，配体或受体的表面表达是免疫反应的第一调节因子，而HypoExos可以改变其表达。此外，外泌体货物可能是免疫配体。因此，需要探索缺氧对PD-L1负载到外泌体的影响。此外，缺氧肿瘤外泌体可直接影响配体受体途径下游因子，使其绕过配体或受体引起免疫应答。

5、代谢重编程

代谢在癌症生物学中有着重要的作用，因此探索外泌体在缺氧TME代谢中的作用是很有必要的。癌细胞即使在常氧状态下也会发生代谢重编程(如Warburg效应)，缺氧导致的代谢物变化可能会影响外泌体的货物负载。外泌体的组成可以反映肿瘤细胞的缺氧状态，这可用于跟踪代谢重编程。此外，常氧外泌体和缺氧外泌体都可以重新编程受体细胞的代谢，包括浸润性免疫细胞。外泌体可为缺氧的肿瘤细胞提供营养。除了影响营养供应外，这些外泌体代谢物极有可能影响靶细胞，特别是免疫细胞。

6、治疗抵抗

与传染病类似，癌症往往对各种疗法产生耐药性，从传统的化疗和放疗到靶向疗法和免疫疗法。新生血管功能失调会导致肿瘤微环境缺氧，减少肿瘤对药物的有效暴露，将缺氧与治疗耐药性联系起来。此外，暴露在缺氧环境下会导致新陈代谢的重新编程，这也会使肿瘤细胞对各种疗法产生抗药性。许多以前的研究已经证明，外泌体可以将治疗抗性从不敏感的肿瘤细胞传递到敏感的细胞，最终导致更恶性的肿瘤或复发。因此，需要对缺氧TME中的外泌体进行研究。

Fig.5 外泌体的异质性及其在低氧TME中的生物功能

章节五：外泌体在缺氧TME中细胞间通讯

缺氧以及其他选择压力促进了肿瘤微环境中恶性和非恶性细胞区室的趋同进化和多样化，从而导致肿瘤内异质性(ITH)的时空进化。例如，在缺氧状态下，肿瘤的供氧随着与新生血管间距离的增加而减少，这反映了空间瘤内异质性，而随着肿瘤进展而出现的缺氧区反映了时间瘤内异质性。由于瘤内异质性对肿瘤进展和治疗反应具有重要的影响，因此研究肿瘤微环境间室之间的通讯，监测动态ITH和靶向ITH是非常重要的。

外泌体连接恶性和非恶性室的TME不仅发生在常氧条件下，还发生在缺氧条件下。来自缺氧成纤维细胞（CAFs）的外泌体可以通过circHIF1A促进乳腺癌细胞的干性，来自缺氧NSCLC细胞的外泌体可以重编程CAFs形成酸性微环境，导致非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和顺铂耐药。

此外，来自不同肿瘤细胞的外泌体在缺氧条件下可以通过不同的miRNA促进肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M2极化，而来自缺氧CRC肿瘤细胞的外泌体可以培养远处的Kupffer细胞（巨噬细胞）形成向肝转移的PMNs（pre-metastatic niches）。树突细胞（DCs）衍生的外泌体中的货物会因缺氧而改变，但在缺氧的TME中，DCs与肿瘤细胞之间的相互作用在很大程度上仍未被探索，需要更多关注。有趣的是，来自缺氧自然杀伤细胞(NK)的外泌体具有更强的抗肿瘤能力而不是更低，而来自肿瘤细胞的 MVs（不是外泌体）可以通过 TGF-β 和 miR23a 削弱 NK 细胞的抗肿瘤作用。

章节六：临床应用

随着精准医学的发展，精准肿瘤学和液体活检的应用也在不断发展。传统的从单个或少数空间区域获取的组织活检样本可能会受到限制，无法反映全身的肿瘤状态。评估循环肿瘤 DNA (ctDNA)、EVs 或外泌体、循环肿瘤细胞 (CTC) 和其他生化物质等因素的液体活检策略似乎能够克服这些缺点。

外泌体在生化因子中是独特的，因为外泌体不仅包含DNA，还包含各种蛋白质、RNA、糖缀合物和脂质，显示出更多潜在的临床应用，而且由于外泌体更容易获得（在几乎所有体液中都可检测到），这使它们成为监测ITH动态的理想生物标志物，为诊断和预后预测提供有用的临床信息。这些特征允许对治疗进行动态调整，以获得更好的结果，并最大限度地减少毒副作用。

例如，成像技术只有在形态学上可见时才能检测到癌症，而此时，癌症已经相对晚期，甚至可能已经转移。循环外泌体可用于早期诊断，允许及时的临床干预。用外泌体监测动态 ITH 可能有助于及时解决可能的不良事件。利用可接近的循环外泌体可以避免造影剂或侵入性组织活检引起的意外并发症。使用外泌体预测治疗反应避免了药物对药物不敏感患者造成的伤害。这个领域正在经历令人兴奋的发展。许多外泌体作为诊断或预后评估工具的临床试验正在进行中（Table1）。

Table.1 关于外泌体生物标志物的临床试验

与缺氧相关的外泌体生物标志物不仅反映了肿瘤的缺氧状态，而且反映了肿瘤的侵袭性和预后。例如，缺氧调节的 mRNAs和蛋白质在缺氧的神经胶质瘤细胞中富集，而其中一些标志物水平高的患者往往存活率更差。然而，癌细胞中的HypoExo生物标志物缺乏大规模临床试验的验证。

外泌体的另一个临床应用是利用它们的天然抗肿瘤特性。来自免疫细胞，甚至是肿瘤细胞的外泌体具有抗肿瘤能力。因此，如何利用或靶向缺氧来增加外泌体中的抗肿瘤货物是值得探索的。除了使用来自细胞的外泌体外，人工制造是将功能性货物或药物装入外泌体的另一种方法(Fig.6)。

Fig.6 基于外泌体的治疗方法

Ref：The evolving translational potential of small extracellular vesicles in cancer. Nat Rev Cancer. 2020;

结论及未来工作：

随着肿瘤的扩增，出现缺氧现象。为了在这样的微环境中生存，肿瘤细胞采取各种行动——释放外泌体，向其他细胞传递信号，引发促癌效应（如诱导血管生成信号）或防御信号（如诱导侵袭和转移信号）；鉴于对缺氧和外泌体理解的不完整，无法建立一个完整的框架来理解缺氧中的外泌体。然而，仍然可以得出以下结论：

1. 缺氧通常（但不是总是）通过直接（物质分拣、MVBs的运输与质膜的融合）和间接（代谢重编程、酸性微环境的诱导）的方式增加各种肿瘤细胞的外泌体分泌，但还需要一个更详细的机制。

1. 缺氧会影响外泌体的大小、载物量和细胞来源的异质性，从而改变生物功能。
2. 外泌体大小的改变可能反映并促进ITH的进化，但由于缺乏缺氧如何影响外泌体大小的证据，因此要得出有效的结论还为时过早。
3. 外泌体物质在缺氧和常氧时是不同的。缺氧会影响物质的生物合成、代谢降解和合成后修饰以及特殊货物分拣机制的效率。
4. 由于外泌体嗜酸，缺氧微环境可能促进外泌体转运。此外，缺氧还可能通过影响能量供应和诱导低pH等辅助或间接方法改变识别分子和各种内化途径，从而影响外泌体靶细胞识别和外泌体内化。
5. 缺氧TME中，外泌体通常发挥促癌作用，但有时也具有抗肿瘤的能力。信号通路介导和受体细胞的代谢重编程是外泌体在缺氧TME中发挥生物学功能的两种主要调节方法。与药物的竞争性相互作用是外泌体在治疗耐药中的另一个不可忽视的作用。
6. 缺氧是瘤内异质性进化的主要原因之一，瘤内微环境的外泌体可用于研究ITH间室之间的通信、监测动态ITH和靶向ITH。此外，在缺氧的肿瘤微环境中，外泌体是用于恶性-恶性之间、良性-良性之间、和良性-恶性之间的普遍通信机制。
7. 外泌体是监测动态 ITH 的理想生物标志物，可为诊断和预后提供有用的临床信息，允许改变治疗以获得更好的结果，并最大限度地减少毒性和副作用。此外，去除和靶向促肿瘤外泌体、利用抗肿瘤外泌体和使用经过工程改造以携带特定货物或药物的外泌体用于癌症治疗是其他潜在的临床应用。将这些策略与与缺氧相关的策略相结合可能会为癌症治疗提供新的途径。

缺氧TME下的外泌体这一领域未来值得探讨。使用强大的单细胞序列来探索缺氧在肿瘤中的作用，对不同亚群的外泌体在不同时间、不同空间收集组织进行单细胞测序，研究缺氧条件下外泌体更加复杂的作用和变化，这可能有助于精确重构TME结构。总之，在未来随着单细胞转录组学和空间转录组学策略的发展，挑战将会增加，机遇也会增加。