外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（五）

今天分享一篇发表在Journal of Translational Medicine（2020年IF=4.124）上的文章，名为《Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma》[1]（ 通过尺寸排阻色谱分离的细胞外囊泡适用于血浆中的RNA组学分析）。

近年来，越来越多的研究报道，丰富的循环RNA可作为预后的标志。例如，血清需高温蛋白A2 (HtrA2)被报道与乳腺癌的进展有关，特别是与CA15-3和CEA联合可提高诊断效率。此外，血清HOX转录反义RNA (HOTAIR)和miR-146的表达对慢性髓系白血病的伊马替尼治疗具有诊断价值或可作为灵敏的标记物。然而，血清中存在的RNA是不稳定的，这限制了RNA的临床应用。在这种情况下，细胞外囊泡(EVs)中的RNA和RNA组学为疾病诊断提供了一个潜在的生物标志物，因为EVs可以保护RNA免于降解。细胞外囊泡(EVs)的直径范围为40 ~ 1000 nm，是由蛋白质标记物(如：TSG101、ALIX、CD63等)和多种生物分子，如蛋白质、核酸、聚糖，以及其他信号分子。EVs可在几乎所有体液中观察到，并可被大多数细胞释放，发挥各种功能。EVs在特定细胞间运输生物分子的能力赋予其作为靶向药物递送载体和诊断标记物的应用潜力。

由于许多研究报道EVs可能与疾病进展密切相关，并提出其作为各种疾病的新型生物标志物的作用，应尽快开发EVs纯化的最佳策略。虽然有几种方法可以纯化EVs，包括超离心、过滤、沉淀、层析、免疫亲和捕获，以及应用上述技术的商品化试剂盒。然而，很少有证据表明，通过上述方法分离的EVs能够提供下游功能研究。目前，所有的技术都提供了不同等级的EVs的回收率和纯度。一般来说，无法从EVs中分离出的杂质具有与其相似的尺寸或密度，因此不能以单一方式分离。这些技术的组合可以提高分离EVs的纯度，但代价是明显降低回收率。随着医学和生物学的发展，生物样品的多样性和下游分析的复杂性也对EVs的纯化提出了更高的要求。

根据公共数据库(http://www.exocarta.org)，多达3000个mRNAs和2800个miRNAs已在EVs中被鉴定。此外，越来越多的证据表明，lncRNAs可以通过EVs进行分类，并影响肿瘤发生、脑功能障碍等疾病。RNA测序是液体活检中最广泛使用的基于EVs的生物标志物开发技术，大量体液源EVs中的RNA已被报道为潜在的诊断标志物。一般情况下，不同EVs分离方法获得的RNA在效率、RNA分布特征、覆盖程度等方面可能存在差异，导致分析结果的重复性较差。因此，在确定研究方案之前，需要综合比较现有的EVs中RNA测序提取方法的性能。

本研究中比较了4种最终用于RNA组学分析的EVs分离方法的性能，包括UC、SEC、ExoQuick和exoEasy kit。据我们所知，本研究首次全面比较了目前最常用的四种EVs分离方法的RNA组学性能。本研究可能为理解EVs分离方法提供更多的见解，并为进一步研究基于EVs的组学分析奠定基础。

研究过程：

一、准备血浆

采集同一供体4 mL新鲜血浆(采集后30 min内完成预处理，立即进行EVs分离，不需冷冻)，平均分成4等份，每等份采用一种特定的提取方法。来自同一供体的样品，在一致的预处理条件下，将使实验过程中的个体因素影响最小化。EVs的分离是在没有冷冻的情况下进行的，以便将冷冻对样品质量的影响降到最低。全血标本在室温下暂时保存于EDTA采集管中(不超过30分钟)。在处理前，必须确保没有观察到可见溶血。室温下1600 g离心15分钟，使细胞沉降。将上清转移到新的EP管中，10000g离心30分钟，在室温下清除碎片和大囊泡。使用前应准备好血浆样品。

二、EVs分离

本研究比较了4种EVs分离方法：超离心(UC)、exoEasy kit (QIAGEN)、排阻层析(qEV [Izon]、Exosupur [echobiotech])、ExoQuick kit (Thermo Fisher)。

1. UC分离EVs：血浆样品2000 g离心10 min，上清用0.22µm(Corning)过滤系统过滤。然后100000 g 4°C离心2 h(SW 55 Ti转子，Beckman Coulter)，然后用PBS洗，100000 g 4°C离心2 h。沉淀用1×PBS重悬。
2. exoEasy分离EVs：预过滤血浆在4°C下3000g离心15分钟。在1体积的样品中加入1份XBP缓冲液。将试管轻轻翻转5次，混匀溶液，并将混合物置于室温。将混合物加到exoEasy柱，500 g离心1分钟。丢弃流出的溶液，将柱子置于同一收集管中，加入3.5 mL XWP缓冲液，5000 g离心5 min，去除柱中的残余液体。弃去所有流出的液体。将柱子移至新的收集管，吸附在柱上的EVs可以用XE缓冲液洗脱，用于BCA、NTA和TEM分析，或用QIAzol试剂进行RNA分离。
3. SEC分离EVs：SEC按说明书(QEV (Izon)，Exosupur (echobiotech))进行。简单地说，先将血浆样品2000 g离心10 min，离心后用0.22µm过滤系统过滤上清。然后，将血浆添加到柱的顶部。用1×PBS收集含有EVs的部分。收集的组分用100 K Amicon Ultra-15离心过滤装置(EMD Millipore)超滤浓缩。
4. ExoQuick分离EVs：将血浆样品3000g离心15 min，上清转移至无菌管中。加入ExoQuick试剂，将离心管倒置数次，充分混合溶液。4℃静置，1500g离心30 min，吸出上清，1500 g离心5 min，吸上清。加入1×PBS重悬沉淀。

三、纳米流式检测（NanoFCM）

在测试前分别用浓度标准品和粒径标准品进行参数校准。采用纳米流式检测仪收集1分钟。根据标准品测定样品的颗粒浓度和颗粒直径。

四、透射电镜（TEM）

新鲜分离的EVs悬液用4%多聚甲醛固定1h。从不同样品分离的EVs悬液(各约5μL)加到铜网形式涂层碳稳定网，让铜网吸收4 - 5分钟，然后用滤纸擦除。EVs负染时，1%醋酸铀酰水溶液(5 μL)置于铜网上30 s，然后用Whatman滤纸擦除。彻底干再进行观察。

五、Western blot分析

在提取的EVs样品中加入200 μL带有蛋白酶抑制剂的冰冻NP-40缓冲液，悬浮于合适的缓冲液中，制备蛋白样品。每10分钟混合摇匀一次，然后在冰中孵育50分钟。蛋白质浓度通过BCA (Applygen)检测。然后加入2 ×上样缓冲液(200 μL)，搅拌均匀，加热至沸腾。蛋白质样品(50 μg)用8-10% SDS凝胶分离，在PVDF膜上进行免疫印迹。然后用BSA阻断1 h，一抗(APOB、AGO2、HSA、Alix、Tsg101、CD9或CD63)在4℃孵育过夜。然后用含0.1% Tween的Tris缓冲盐水洗涤膜，与二抗室温孵育1 h。然后，再次清洗薄膜，并暴露于ECL(电化学发光)。

六、ExoRNA分离和RNA分析

使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据说明书操作。在1.5%琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染，特别是DNA污染。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)和安捷伦生物分析仪2100系统的RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies)评估RNA浓度和纯度。所有RNA测序均使用单一样本进行。

七、文库制备和测序

用Ovation®SoLo RNA- seq Library Preparation Kit (NuGEN)将每个样本共5ng RNA作为测序库的input，并将 index codes添加到每个样本的属性序列中。对于小RNA库，每个样本取2.5 ng RNA作为RNA样品制备的input。使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB)生成测序库，并将index codes添加到每个样本的属性序列中。最后，利用AMPure XP系统对PCR产物进行纯化，并用Agilent Bioanalyzer 2100和qPCR对文库质量进行评价。在acBot聚类生成系统上使用TruSeq PE Cluster Kitv3-cBot-HS (Illumia)，对样本进行聚类。聚类生成后，利用Illumina Hiseq平台对文库准备进行测序，生成双端reads。

八、数据分析

变量平均值的比较采用SPSS 19.0统计软件。数据以mean ± SEM表示。GraphPad Prism用于统计分析和图形生成(GraphPad Software)。在使用Shapiro-Wilk和Levene检验正态性和相同的方差后，使用Kruskal-Wallis检验分析异常平均值之间的差异。P值< 0.05为有统计学意义。

结果展示：

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参考文献：

[1]Yang, Y; Wang, Y; Wei, S; et al.Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma.[J].J Transl Med.2021,19(1):104