外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十七）

今天分享一篇发表在International Journal of Molecular Medicine（2021年IF=4.101）上的文章，名为《Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profifiling on High-Resolution Single-Particle Platforms》[1]（用高分辨单粒子平台进行细胞外囊泡图谱分析的荧光标记方法的机遇和挑战）。

在过去的二十年里，随着一些杰出的发现，EV的研究呈指数级增长，这些发现揭示了EV介导或直接执行的许多生物功能。这些膜封闭的纳米颗粒实际上封装了在各自的供体细胞中发现的任何生物分子类型，即：DNA、RNA、蛋白质、脂质或代谢物。人体中几乎所有的细胞都在积极地分泌EV，它可以通过各种生物液体循环，如血浆、尿液或唾液。最近，科学界意识到，EV是衡量个人健康状况的非侵入性指标。这引发了发现EV特异性生物标志物的赛道，目标是改进或使多种疾病的检测成为可能，并将新的非侵入性实践转化为常规临床应用。由于小EV(sEV)，通常在纳米级范围内(30-200nm)，有高度的异质性，与其他生物纳米颗粒难以区分，因此亟需真正的单囊泡鉴别、分析和表征的方法。为此，探索了高分辨率方法，如纳米颗粒跟踪分析(NTA)，可调电阻脉冲传感(TRPS)，拉曼光谱，原子力显微镜，超分辨率显微镜，和纳米流式检测技术。依赖于无标记EV分析的技术可以估计颗粒大小、浓度和其他物理参数，如zeta电位。专注荧光测量的方法有助于确定样品内标记颗粒的性质或组成。因此，很明显，结合无标记和荧光测量的方法可以提供稳定的方法，以区分复杂样本中的真实sEV，并定量表征相关亚群，这些亚群通常以极低的丰度出现。

在传统的流式细胞仪中，光散射测量本身可以对微观粒子进行高通量多参数分析，可以与荧光标记结合来精确定位和表征特定的成分或生物过程。然而，由于粒子和光的物理性质，传统的流式细胞仪无法检测到200nm下的颗粒。总之，对于尺寸小于入射光波长的粒子，散射光的强度降低了一个数量级（六次方关系）。为了准确地检测sEV，目前最先进的专用平台已经开发出来，以提高纳米颗粒分析的灵敏度。

NTA已广泛应用于基于粒子在悬液中布朗运动的计数和估计。该平台具有高分辨率的能力，可以检测小至30nm的生物粒子；然而，较大粒子(>1µm)的测量精度往往较低。除了尺寸和浓度外，还可以分析多个附加参数，如zeta电位、体积、表面积、光强和粒子的长宽比，为多分散样品提供了多方面的生物物理评估。最近，NTA平台开发了优化的荧光模式(F-NTA)，允许对样品中分析的颗粒进行表型表征。荧光团的稳定性和强度是精确测量较小粒子的关键因素，而可靠捕获这些信号所需的灵敏度使仪器更容易受到背景噪声和污染物的影响。

所有的sEV在结构上都很相似。它们被脂质膜包围，在一个明确的大小范围内，并携带在各自的供体细胞中发现的不同类型的生物分子。内容物装载和释放，虽然尚未完全阐明，但是形成每个sEV的独特特性，因此导致了囊泡亚群之间广泛的异质性。真正的sEV的鉴定和表征需要对其含量进行生化分析，通常依赖于脂质膜上表面蛋白的存在或缺失(即经典的四酯蛋白CD9、CD63和CD81)。含有内部标记的亚群也可以用特定的膜透性染料来识别。

近年来，人们提出了几种EV标记的策略。这些通常包括应用于细胞的荧光染料的适应染色方案。用于EV标记的染料是根据它们对不同的EV成分，如蛋白质、脂质或核酸的特异性来选择的。此外，我们应用荧光标记的抗体来探测特定的外膜分子。nFCM是一种专用的高分辨率纳米流式检测平台，将单粒子荧光检测与各自的散射光相结合，可检测到40nm以下的生物颗粒。为了解纯化EV或细胞条件培养基(CCM)的优化染色方案是否可以在不同平台之间横向应用，我们进一步在F-NTA中进行了测试。最后，我们发现了单个sEV识别的一些主要障碍，这些障碍通常与潜在的共分离污染物有关，如大型蛋白质复合物、可溶性蛋白或细胞培养基成分。

研究过程：

一、用膜染料和细胞质染料标记EV

本研究评估了不同的染色方法。一种是使用两性分子对EV的脂质膜成分进行染色，如CellMask™ (CM)质膜染色、CMG和CMR，它们分别发出绿色和红色荧光。其次，用CellTrace™ 细胞增殖染料，如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)和CellTrace™ Red(CTR)。这些染料只在发射荧光的波长上有所不同(CFSE：绿色；CTR：红色)，但它们的作用机制是相同的。简单地说，染料分子很容易穿透EV的脂质双分子层，被酶的裂解激活，并与EV腔内的蛋白质共价结合。这一过程有效地将染料分子困在每一个EV中，产生稳定的荧光信号。HT29sEV样品中超过90%的颗粒被CMG、CMR、CFSE和CTR染色，并在nFCM上检测(图1A)。较大的sEV在点图上显示出明显较高的荧光强度，这可能是由更多的染料分子的掺入引起的(图1B)。染色方案也在F-NTA上进行了测试，其范围是在一个最先进的正交平台上进行验证。CFSE在F-NTA上的染色性能为~88%，与nFCM上检测到的染色性能相当(图1A)，但需要更高浓度的染料(F-NTA中50µM，在nFCM测量中使用10µM)。另一方面，CMG的染色效率较低，在20×CMG浓度时，最大~值为32%(图1A)。颗粒大小分布(PSD)直方图显示，在F-NTA上普遍检测到更大的颗粒，因为它们含有更多的染料(图1C-CMG)。在酶标仪上测量的体积荧光信号-背景比与所有染料染色颗粒的数量呈线性变化，尽管绿色染料CFSE和CMG都获得了最高的灵敏度(图1D)。

为了控制染料的特异性，除了强制使用空白对照和未染色的对照外，本研究还纳入了一种称为甲状腺球蛋白的蛋白质。由于其规模较大，单个颗粒可以在侧向散射通道中被接收到。然而，几乎没有甲状腺球蛋白颗粒被CMG染色，CFSE染色后，即使经过300kDa超滤(UF)洗涤，F-NTA中检测到的荧光颗粒数量也超过散在的数量级。在nFCM中，也检测到CFSE标记的甲状腺球蛋白颗粒（数据未显示）。在CFSE染色的BSA对照中，F-NTA中观察到类似程度的染料活化，而UF成功地消除了所有荧光颗粒。

二、利用单荧光团四酯蛋白标记策略来表征sEV亚群

为了鉴定在nFCM上sEV检测具有最大敏感性的荧光染料，我们比较了ht29衍生的sEV与偶联PE、AF488、AF647和APC的抗cd9一抗的染色。PE和AF488获得了最大程度的CD9染色，因为两者都可以检测到相似比例的CD9亚群比例（接近50%）。红色荧光AF647和APC对CD9+sEV的染色程度不同(图2A)。此后，在nFCM实验中，我们选择了PE和AF488偶联抗体，由于其亮度较高，以PE作为参考荧光。尽管它的亮度极高，PE的高光漂白率使它不适合F-NTA平台，其中精确的测量依赖于更长时间的信号采集。因此，我们选择AF488在F-NTA上进行sEV表型，因为它更稳定。

为了评估所选的荧光团是否确实表现同样好，我们用PE或AF488偶联的抗CD9、CD81和HEK293sEV进行染色，然后进行nFCM分析(图2B)。在HT29 sEVs中，CD9为51%(PE)/50%（AF488），CD63为31%(PE)/18%（AF488），CD81为69%(PE)/66%（AF488）。对于HEK293 sEVs，检测到的CD9+占36%(PE)/42%（AF488），CD63占12%(PE)/11%（AF488），CD81占45%(PE)/42%（AF488）(图2B)。这两种荧光团通常可检测到相似比例的EV亚群，仅在HT29 sEV CD63检测中观察到主要差异。后者可能是由于不同的抗cd63抗体克隆。为了评估抗体的特异性，除了sEV缺失的空白反应，甲状腺球蛋白也被染色作为阴性对照，因为它是一个蛋白颗粒，不携带四酯蛋白表位。所有抗四酯酶抗体的标记都可以忽略不计，特别是PE标记。CD63-AF488显示出最高程度的非特异性染色。

四酯酶的表达在不同的细胞类型和EV批次中都有差异。当在nFCM和F-NTA上对两个独立收获和纯化的HT29sEV(A批次和B批次)进行比较时，我们确定了四酯蛋白表达的变化(图2C)。纯化sEV，从两个不同批次的HT29CCM与AF488标记抗体染色，显示不同nFCM CD9（50.6% vs. 65.7%）和CD81(66.6%vs.48.7%)，而CD63（17.9% vs.11.9%）差异没有统计学意义(双向方差分析，Tukey的多重比较检验，alpha=0.05)。F-NTA中B批次sEV的染色和分析显示，CD9、CD81和CD63分别为30.7%、22%和1.9%，明显低于A批次(CD9=54.9%，CD81=45.5%；CD63=3.9%)。尽管每个四酯酶的表达在不同批次之间存在显著差异(特别是CD9和CD81)，但在F-NTA中，它们的相对表达趋势保持不变：CD9>>CD81>>CD63(F-NTA批次#A和批次#B-图2C)。相反，在nFCM中，四酯酶的相对表达在不同批次之间略有不同(批次#ACD81>>CD9；批次#BCD9>>CD81)。从平台间比较的角度来看，除A批次的CD9外，两个平台的表达存在显著差异(双向anovy，Tukey多重比较检验，alpha=0.05)。仅在B批次(CD9>>CD81>>CD63)中获得了平台间相当的表达趋势。

为了分析这些四酯蛋白的单表达和伴随表达，HT29 sEV用双染(CD9+CD63；CD9+CD81；CD81+CD63)和三抗体组合(CD9+CD81+CD63)染色，与PE偶联在nFCM上检测，AF488在F-NTA上检测。在nFCM上观察到的所有粒子中，近76%含有CD9、CD81、CD63或它们的组合(图2E，左)。双抗体或三抗体染色检测到的百分比不是纯累积的，这与每个sEV可能同时表达一种、两个甚至三个四酯酶的预期一致。所有四酯酶阳性的sEV可以在F-NTA上重复，76%的颗粒被三抗体混合物染色(图2D)。F-NTA检测到的双阳性sEV比例比之前检测的单染色更为显著增加，抗cd9/抗cd63混合染色47.6%，抗cd9/抗cd81染色79.4%，抗cd63/抗cd81染色37.8%。尽管信号远高于单个染色反应的总和(例如，CD9/63>CD9+CD63)，但表达模式保持了个体四酯蛋白表达的预期趋势——CD9/81>>CD9/63>>CD63/81。

经过双抗体和三抗体染色，了解每个单一四酯蛋白的表达，可以通过维恩图交叉分析计算出共同表达这些标记物的sEV亚群。由于nFCM中70%与抗CD9/抗CD63共染色，72%与抗CD9/抗CD81共染色，75%与抗CD63/抗CD81共染色，我们可以估计17%的HT29sEV共表达CD9和CD63，50%共表达CD9和CD81，约20%共表达CD63和CD81，只有11%同时表达这三种四酯蛋白(图2E)。有趣的是，我们注意到，在我们的HT29 sEV样本中，CD9+占51%，CD9+CD81+占50%，这意味着所有CD9+颗粒也表达了CD81(图2E，右)。

三、SEC纯化和超滤不会改变sEV亚群的总体组成

优化的sEV染色方案包括一个缓冲液交换的过滤步骤，它能够保留sEV，并去除过量的染料和抗体。在测试了几个过滤装置后，为此目的选择了Nanosep300kDa超过滤器和SEC。一个主要的问题是，背景荧光可能会掩盖来自荧光标记纳米颗粒的微弱荧光信号，并阻碍真实阳性事件的获取，从而导致检测结果偏差。事实上，游离染料和抗体影响了sEV分析，正如在F-NTA上清楚地显示的那样，荧光背景导致了对标记效率的过高估(图3A)。荧光标记sEV的PSDs也受到影响，尺寸分布向左偏移，在50nm以下出现一个峰值。同样，在nFCM上，溶液中过量的游离荧光团导致荧光通道基线的升高。因此，过滤被证明是可靠检测标记囊泡的关键步骤，因为即使是游离染料和/或抗体的痕迹也会在两种仪器上产生很强的荧光背景。

尽管如此，我们质疑这些缓冲交换方法是否会无意中选择特定的sEV亚群，从而导致偏倚分析。为此，用PE偶联的抗CD9、CD63或-CD81对HEK293 sEV(10^8个颗粒/µL)进行染色，并在nFCM上对样品过稀释、SEC和UF进行比较。样品过稀释指进行完整的染色反应后用PBS稀释，直到未结合荧光抗体的浓度足够低以避免背景荧光，而sEV浓度保持在测量的最佳范围。由于过度稀释法本质上是无偏倚的，它的功能是作为参考染色。无论采用何种方法，我们都没有观察到四酯蛋白表达水平之间的显著差异(图3B)，这表明SEC和UF都没有改变sEV亚群的组成。样本PSDs的平均值和中位数也支持这一点(图3C，D)。

四、RNA染色后sEV群体的鉴定和定量

为了进一步表征HT29sEV亚群，我们用RNA-SYTO™RNASelect™和Quant-iT™RiboGreen™这两种膜透性染料评估其核酸含量。由于这两种染料只有在与RNA结合时才表现出充分的亮度，与PE或AF488相比，未结合的染料分子产生的背景信号应该显著降低。这种推理促使我们在这种背景下探索样本过度稀释方法的适用性。经过过稀释染色反应后，nFCM检测到的Syto和RiboGreen的荧光亚群平均分别约为10.2%和10.6%(图4A)。然而，相对于样品过稀释参考，UF洗涤导致两种染料的荧光事件持续下降。UF后荧光事件的丢失也反映在PSDs上，因为观察到直径较小的颗粒明显减少(图4B)。

在F-NTA上分析Syto和Ribo Green染色HT29 sEVs，也进行了类似的观察。即使在使用的最高浓度（100 μM）的染料中，Syto（＜2 %）也没有检测到明显的荧光信号（图 4C）。相反，用不同浓度的 Ribo Green 染色的 sE Vs 达到了25 %的标记效率（图 4D）。值得注意的是，检测到的荧光颗粒显示出较大的PSD的趋势。然而，用 UF 洗涤样品后，荧光信号完全丢失（图 4D）。空白对照组（无 sEVs）显示两种仪器上荧光事件的数量可以忽略不计，表明无论是洗涤前还是洗涤后，仅游离染料不会产生假阳性计数。

五、细胞条件培养基中sEVs的直接识别和定量

理想的单粒子表征需要纯化的EVs。然而，纯化过程可能是耗时耗力的，如果该过程丰富了某些EV亚群也会造成结果偏倚。为了评估从CCM sEV纯化，同时仍然准确地检测 sEV 亚群的可能性，先前优化的染色操作直接应用于 HT29 CCM，并由nFCM还有F-NTA测试结果如图 5A 所示，CFSE 和CMG 标记了 90%的颗粒。nFCM很好地重现用纯化的 HT29 sEVs得到的结果(图1A)。相反的，HT29 CCM上的CFSE染色和CMG染色导致F-NTA上的标记率分别仅为33%和27%(图5A)。荧光亚群的峰值和总体PSD倾向于更高的值，而不是在散射模式下测量的总粒子。

在HT29 CCM中直接孵育抗四酯蛋白抗体和随后的nFCM分析显示，与纯化的HT29 sEV相比，四酯蛋白表达谱略有变化。CD9的阳性事件百分比为59%，CD81为67%，CD63为23%(图5B)。在F-NTA上，AF488抗体染色的CD9染色为59.8%，CD81染色为35.3%，CD63染色为2.6%(图5B)，高于相应批次纯化的HT29 sEV(图2C，F-NTA)。然而，在HT29 CCM和HT29纯化的sEV(CD9>>CD81>>CD63)之间也保持了相同的表达趋势。补充材料中提供了详细的双向方差分析，比较了纯化(sEVs)和非纯化(CCM)样品之间四酯蛋白表达水平的可变性。

根据上述纯化的纯化sEV实验，我们评估了三种四酯蛋白在HT29 CCM中的伴随表达，应用CD9、CD81和CD63抗体的组合，PE偶联的nFCM和AF488偶联的F-NTA。在nFCM上检测到的近83%的颗粒显示出CD9、CD81或CD63，略高于之前从同一CCM批次中检测到的纯化sEV的76%(图5C)。在nFCM上，15%的颗粒同时携带CD9和CD63，近50%的颗粒同时显示CD9和CD81,13%的颗粒CD63和CD81均为阳性，10%的三种标记均为阳性。四酯酶的表达谱与在纯化的sEV中获得的表达谱相同，证明其最大波动仅为7%(图2E和5C)。

AF488偶联的抗体组合在CCM上没有重复出相同的值，这与在F-NTA上纯化的EV相同。双染色和三重染色反应证明了不现实的荧光颗粒数，产生超过100%的散射模式检测到的颗粒。在一个复杂的、未纯化的生物流体中，多种抗体的组合可能导致未结合抗体的过量难以去除(图5D)。背景荧光阻碍了正确的分析，如PSD直方图在散射模式和荧光模式之间的变化所示(图5E)。

六、利用多色荧光标记策略来表征sEV亚群

根据生物样本的复杂性，广泛的污染物可以与sEV共分离，从而增加了亚群已经很高的异质性。因此，在提取关于其性质和/或内容的额外信息的同时，精确定位和区分真正的sEV和混淆粒子是至关重要的。这促使我们尝试多种标记策略，结合不同的染料和抗体。首先，将纯化的HT29 sEV分别用CD9-AF488和CD81-PE染色，分别测定各标记物的表达。然后，结合两种抗体，并比较染色效率。CD9-AF488单独染色50%的颗粒，并与CD81-PE联合染色，这一数字略有增加到55%。CD81-PE在单次染色时获得的标记效率为70%，与CD9-AF499一起孵育后获得的标记效率为68%(图6A)。对于双阳性CD9+/CD81+的亚群，48%的颗粒显示双荧光信号，与CD9和CD81的共表达水平完全匹配，之前使用严格PE抗体组合的HT29 sEVs中发现(图2E和6A)。为了进一步区分抗体标记颗粒的性质，我们试图优化应用CTR和CD81-AF488的双染色方案。每种染料获得的标记与单个染色对照很好地匹配。我们观察到，整个CD81+亚群可以同时用CTR染色，从而支持真正的sEV的存在(图6B)。令人惊讶的是，HT29 sEV在本实验中表达了近40%的CD81，而在之前的实验中检测到的比例为65-70%(图2B)。

讨论：

在本研究中，我们比较了单个纳米囊泡分析平台，并借助于不同染料和抗体的荧光标记。为此，我们评估了两个平台的能力，nFCM和升级的NTA（兼容荧光模式的F-NTA）。虽然这两种仪器都进行单粒子分析，但它们的硬件组件和操作模式存在很大差异。nFCM收集散射光来估计粒子的大小，而F-NTA通过跟踪粒子的扩散运动来计算它们的水动力直径。

nFCM粒径估计的准确性依赖于使用具有与sEV相近折射率的硅球对仪器进行校准。所得到的校准曲线符合瑞利散射理论，因为它们符合小于入射光波长的粒子的光散射的预期模型。然而，硅珠的折射率(RI)（1.46）与EV的RI（1.36-1.4）并不完全匹配，考虑到EV大小和生物分子结构的异质性，粒子亚群之间的折射率特性可能导致差异。为了解释这些限制，nFCM中的尺寸测量实现了Mie散射理论计算，它调整校准曲线，以最小化由尺寸标准和EV之间的差异造成的任何潜在误差。

另一方面，NTA需要更长的采集时间窗来确定颗粒大小，而多分散样品的分析需要调整策略，以包含更广泛的尺寸。此外，由于较大的粒子扩散速度较慢，基于布朗运动的精确尺寸估计具有挑战性，这可能会受到EV表面组成、介质粘度和温度的影响。NTA的优势在于它是一种成熟的方法，不依赖于RI，它为测量不同成分的纳米颗粒提供了很大的灵活性，而在每次分析中都不需要参考材料。然而，在荧光标记和检测方面，NTA存在一定的局限性（需要明亮和稳定的荧光团；更长的信号采集时间），需要进一步的开发和优化。此外，与CMOS相机传感器相比，nFCM中的雪崩光电二极管(APD)可能具有更高的分辨率和更好的信号检测能力，特别是在荧光模式下。

在这项研究中，F-NTA测量比nFCM需要更多的洗涤时间来完全消除背景荧光。更强的激光功率(15mW nFCM vs. 40mW F-NTA)，F-NTA是从测量窗口的静止液体中需要更长一段时间获得荧光信号，相比而言nFCM是快速检测连续流，而nFCM应用SSC触发测量的荧光，因此对背景噪声会比F-NTA更敏感。在分析更复杂的生物液体时尤其如此，如CCM，这引起了人们对非纯化基质中有限的EV分析的关注。

尽管需要更多的洗涤时间，纯化的sEV的分析可以在两种仪器上进行。细胞质染料，特别是CFSE，在两种仪器上都表现得相当好，代表了荧光强度和光稳定性之间的最佳平衡。CFSE和细胞微量染料理论上需要酯酶酶解以共价结合腔内蛋白并发出荧光。一些使用各种纳米颗粒分析平台的研究已经将CFSE作为一种选择性染色EV的方法。尽管如此，CFSE和细胞微量染料应该谨慎使用，因为在我们的手中，它们可以独立于腔内酯酶而被激活。非囊泡蛋白的存在和可溶性酯酶的潜在污染可能导致CFSE的激活——这可以通过甲状腺球蛋白颗粒的染色和本研究中报道的BSA对照中大量的荧光伪影得到证明。细胞膜染料(CMG，CMR)没有发挥相同程度的背景荧光；然而，在F-NTA实验中，它们的染色效率检测效果不佳。

对于理想的单纳米颗粒图谱，选择广泛可用的、光稳定的和高亮度的荧光是很重要的。在nFCM上，AF488和PE表现同样好，令人惊讶，比红色荧光团AF647和APC对sEV染色效率更高，尽管AF488理论上的亮度(消光系数x量子产率)最低。一般来说，红色荧光也可能更容易自猝灭，从而降低其量子产率；因此，在单纳米颗粒分析范围内研究这类染料的性质是相关的。对于F-NTA，AF488提供了稳定性和亮度之间的最佳平衡。尽管PE是市面上最亮的染料之一，但由于其快速光漂白，在F-NTA测量中被忽略了，这可能导致对真正染色颗粒的低估。

总粒子数（散射模式）F-NTA比nFCM高了近4-5倍，可能是由于激光功率的差异，入射光源的强度和照亮粒子的组成直接与散射光的强度有关，最终，与可检测的纳米粒子的数量也有关。另一方面，CMOS传感器可能不如APD那样灵敏，这可能导致sEV表面微弱表达表位的检测较差，限制了每个荧光颗粒相关的荧光团数量。这有助于解释在抗体染色实验中，F-NTA检测到的标记百分比显著降低。双抗体染色实验和三抗体染色实验进一步证实了这一推理，其中荧光事件的数量高于每次单次染色后得到的总和(图2C，D)。表面显示很少CD9、CD63或CD81表位的EV在F-NTA上仍然检测不到，直到标记到。然而，F-NTA在批次之间仍然提供了一致的结果，揭示了在单抗体(CD9>>CD81>>CD63)和多个抗体反应(CD9/CD/CD81>>CD9/CD63>>CD63/CD81)的情况下，四酯酶表达趋势相当。

这些限制在nFCM中似乎没有发生，然而，CD63-PE和CD63-AF488分别导致HT29 sEV上31%和18%的染色(图2B)。PE和AF488抗体之间的供应商和克隆的差异可以解释这种差异，尽管仅在CD63和HT29样本上注意到这种差异；使用HEK293偶联的PE或AF488偶联抗体的CD63染色效率是相同的。值得注意的是，据报道，CD63蛋白具有不同的亚型，来自不同的剪接变体或翻译后修饰，这些修饰可能具有功能或形态学意义，并影响它们与其他膜分子的合作。因此，必须更好地了解某些Ab克隆对细胞类型或条件的潜在特异性。另一种可能性与上述现象一致，由于CD63是本研究中丰度最少的四酯蛋白，AF488染色可能会错过携带很少表位的颗粒。一般来说，nFCM能够更好地识别荧光标记的EV，也可以通过单色荧光来表征多个表面标记物分析，这是非常有价值的，特别是在专用的高分辨率平台，仅限于几个通道的荧光检测。因此，我们可以认为nFCM对荧光测量更加灵敏和一致。

对于sEV纯化不可行或最小样品处理的应用，我们不确定我们的sEV荧光标记方案是否可以直接应用于更复杂的生物样本，如CCM。纯化的sEV和CCM sEV在nFCM上的结果惊人地相似。另一方面，F-NTA更混杂，CCM中CFSE的荧光信号可能意味着存在许多非EV颗粒，然而，抗体染色获得的百分比明显高于纯化的sEV。在这一矛盾的背后，可能是由于CCM的丰富性而导致的抗体洗涤效率的降低。双抗体和三重抗体染色实验进一步支持了这一假设，即荧光背景甚至更高，从而得出结论，对于无背景的F-NTA测量，首选纯化材料，或应使用替代洗涤程序而不是UF。需要注意的是，当出现CCM样品和多抗体染色反应时，UF洗涤的效率降低了。

我们还评估了样品过稀释方法作为一种替代染色方案的可行性，以避免进一步处理染料去除。染色反应之前已经进行了优化，保持了一个固定的sEV范围（10^8-10^9），同时滴定染料和抗体以确定它们的最佳浓度（在此时达到染色饱和）。对于染料，稀释方法对任何一种仪器都不可行，因为在样品测量的最佳稀释条件下，背景荧光水平仍然很大。在F-NTA上，当过度稀释应用于抗四酯蛋白抗体染色时，这个问题也持续存在，证实了在优化染色反应后需要进行清洗步骤。相反，该方案可以应用于nFCM，尽管它需要提高纯化的sEV输入浓度（高达每微升10^8个）。这允许在较低的体积内进行染色反应，最小化抗体的数量，同时保持优化的浓度。样品在500-1000倍稀释后可以直接进行分析，对于UF或SEC，sEV染色效率没有任何损失。

基于样品稀释的方案还可作为评估UF或SEC可能引入的偏差的参考方法，在本研究中用于sEV缓冲液交换，并作为EV分离的基准分离方法。我们证实，无论采用何种染料去除方法，CD9、CD81或CD63亚群之间都没有显著差异。通过这种方式，我们证明了SEC和UF都没有改变sEV亚群的组成(图3B)。类似的平均值和中位数的大小值也支持这一说法(图3C，D)。在整个研究过程中，我们倾向于使用300kDa的UF设备，因为这是一种比SEC更实用的方法，也提供了更高的样品处理通量。

对清洗和未清洗的sEV样本的总体比较，证明可以早期评估sEV染色方案的有效性和特异性，包括核酸特异性染料。将RNA特异性染料用于EV表征已经在早期文章中报道过。在本研究中，SYTO™RNASelect™和Quant-iT™RiboGreen™均显示含RNA的HT29 sEV丰度较低。由于这些染料的激活依赖于核酸的结合，由背景荧光信号引起的干扰似乎不太可能，因此成功地应用了样品过稀释的方法。染色颗粒的低百分比不仅影响了EV RNA的总量和可及性，也影响了这里使用的染料的亮度。

根据MIFlowCyt-EV指南，所有实验中均包括了程序和检测对照，以及洗涤步骤。同样，用RNA染料进行的染色反应也进行了UF处理。这降低了荧光百分比，从而得出结论，即RNA染色可能不像其他染料和抗体那样具有特异性或稳定。UF洗涤后荧光颗粒的减少引起了关于染料可能产生的影响的担忧，以及核酸与EV结合的性质和强度。鉴于RNA染料可以最小限度地与DNA分子结合，整体的弱荧光信号可以通过与囊外DNA的低亲和力结合来证明，然后在UF洗涤时丢失。核酸在EV上的存在和拓扑结构一直是以前的研究中讨论的主题，这可能为评估真正的EV核酸含量、位置和它们作为生物标记物的有效性提供了更关键的方法。也有可能荧光颗粒不是sEV，而是大的单个核糖核蛋白复合物。这可以通过与RNA特异性染料和抗四酯酶抗体的共染色实验来解决。虽然他们的空白对照显示出低的荧光颗粒，但我们不能排除SYTO和RiboGreen可能非特异性地吸附到EV上的可能性。

由于nFCM配备了两个荧光通道，它允许共定位分析。双荧光标记被证明是sEV亚群评估的一种可行策略，使用两种抗体的组合或一种抗体与另一种染料，只要它们的发射光谱距离足够远，以避免荧光在通道之间的重叠。这种方法的缺点在于延长了孵育时间，这可能导致染色效率降低——HT29 sEV在双染色后表达了近40%的CD81，而在单染色后CD81表达了65-70%(图2B和6B)。总之，经过仔细优化染色方案后，有可能有效地结合多个荧光团，从而实现多参数sEV表征。

文章就分享到这里，有兴趣的话可以自己找这篇文献具体看，有理解得不对的地方，欢迎专业人士指正，一起交流~

参考文献：

[1]Fortunato, D; Mladenovi?, D; Criscuoli, M; et al.Opportunities and Pitfalls of Fluorescent Labeling Methodologies for Extracellular Vesicle Profiling on High-Resolution Single-Particle Platforms.[J].Int J Mol Sci.2021,22(19):