实验专栏丨攻克免疫荧光，只需完成这一次技能提升！

一、试剂配置

1、IxPBS 缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2 g、 Na2HPO4- 12H2O 2.85 g、KH2PO4 0.24 g， 加双蒸水900ml溶解，调pH值至7.4，量筒定容至IL，高温高压灭菌后使用。

2、0.5%Triton X-100：取50ul Triton X-100加入10mlPBS中，然后放入37℃水浴锅溶解。

二、实验步骤

细胞爬边固定：

1）在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲；

2）醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。

细胞的通透：

打孔：0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min。

封闭：PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。

一抗：水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(GFAP 1:100)并放入湿盒，4℃孵育过夜；

加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；

封片及检测：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜检查。

三、注意事项

1、经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

2、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。　

3、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

4、要单独冲洗，防止交叉反应造成污染；要温柔冲洗，防止切片的脱落；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

5、加入荧光抗体后一定要记得避光！！！

6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。　

7、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可，之后片子可保留更长时间。