SnapGene操作指南 | 反向PCR
上一篇关于PCR技术一文中介绍到，PCR是通过一组序列特异性互补引物在酶促循环温度依赖的反应中扩增DNA的一种技术。点击回顾→SnapGene操作指南 | 聚合酶链式反应(PCR)
而反向PCR（Inverse-PCR）只是常规PCR的一种变体。由霍华德·奥克曼（Howard Ochman）及其同事于1988年一同开发。
在我们深入探讨反向PCR之前，让我们先了解下常规PCR和反向PCR的基本区别。如下图，在常规PCR中，目标DNA是已知的，我们是拥有该序列的信息的。这取决于引物被设计为扩增已知的互补DNA序列。
而在两个不同的单链上在反向PCR中，DNA区域未知，至于基因组中插入哪种类型的DNA，我们没有任何信息。我们设计的引物与已知的DNA区域互补，不是向彼此延伸，而是使DNA彼此远离。如下图，
虽然两种PCR的Taq DNA聚合酶是相同的。在反向PCR中不需要特殊的DNA聚合酶。和DNA一样，引物是相互结合和合成的。
反向PCR技术原理与常规步骤
借助已知DNA区域的序列信息，可以使用已知DNA序列特异性引物将DNA或插入的DNA的未知侧翼区域扩增到循环酶反应中。DNA合成发生在已知的DNA区域之外。
限制性内切是对基因组DNA进行的，它只消化未知的侧翼区域，而不消化已知的DNA区域。连接未知DNA的侧翼区域会产生环状DNA，使用一组引物可以扩增该环状DNA。
实现反向PCR的整个过程一般分为5个步骤：
- 鉴定具有侧翼未知DNA序列的已知DNA区域；
- gDNA的限制性消化；
- 连接消化的未知DNA片段；
- 连接的环状DNA分子的扩增；
- 未知DNA区域的测序；
模拟反向PCR - SnapGene操作步骤
Step 1 选择要删除的区域
选择要删除的区域，例如，点击某个“feature”
Step 2 反向选择
反转所选区域，单击“编辑” → “反转选择（Invert Selection）”
Step 3 打开PCR对话框
Step 4 选择引物
SnapGene支持自动选择引物，输入目标Tm，然后单击“选择引物（Choose Primers）”。
Step 5 引物磷酸化
在“ PCR”对话框中，查看引物名称和磷酸化状态。通过单击5'磷酸化复选框之一，将磷酸基添加到至少一个引物中。
Step 6 验证聚合酶选择
可以点击菜单中的“Creates Blunt Ends”选项进行验证。
Step 7 命名扩增片段
在你准备好模拟反向PCR时，输入扩增片段的名称，然后单击“PCR”。
Step 8 查看片段
线性片段会显示在新窗口中。
Step 9 循环化片段
要循环化片段，单击“Actions”→“Circularize”...
输入Circularized vector的名称，然后单击“Circularize”
Step 10 查看产物
环状产物会显示在新窗口中。
Step 11 查看历史记录
要查看执行的步骤，可以切换到“历史记录”视图，非常方便。
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