细胞凋亡蛋白检测经验交流

本人在做凋亡相关蛋白Caspase-3，Cyt-C，PARP，BCL-2，BAX。在做Caspase-3和细胞色素C的时候遇到了问题，电泳100V压10min，130V跑60min，转膜是0.45微米（跑这种小分子建议用0.22微米），100V,75min。

1，请问贴壁细胞在收集细胞样品提蛋白的时候是否需要收集漂浮的细胞？

2，提蛋白的时候是否一定要严格在4度冰上裂解？我们用的裂解液是博乐的，然后我们提蛋白之前会往裂解液里面加入巯基乙醇，然后裂解之后马上沸水煮样10min。

3，做小分子的时候我cleaved-Caspase3，和Cyt-C一直显不出来或者有时候条带很微弱，是否是样品的缘故（因为我们WB做得很频繁，提完的样品一般是放4度，半个多月就用完了）

有没有做过相关蛋白的大佬能帮忙解答一下，我做了几个月了，WB都还没有想要的结果。