总结一下慢病毒转染293T细胞的实验（原创）

最近在做慢病毒包装，在这里总结一下我在实验中走过的弯路，后面也贴出了现在的实验路线，这是一个成功的套路，也是我本人做的，仅给大家提供一下参考。

实验目的：进行慢病毒包装

实验材料：实验室前辈留下的1：CD513b质粒及两个辅助质粒，2：冻存的293T细胞。

质粒制备：

（1）质粒小抽，测序。 请一定要进行质粒测序！实验中一系列问题，最后还是测序保留资料为证。

（3）质粒中抽。质粒没有问题了，就进行中抽。中抽过程中注意，大肠杆菌摇菌过夜，12~16h，不要超过16h哟~不然会导致内毒素超标，质粒转染效率不高。

细胞培养：

（1）复苏的293T细胞，传代2~3次后使用。整个实验过程中，培养代次尽量不要超过15代，但我前期做到22代，转染效率还可以。现在我们实验室就买了新的细胞系，新细胞系形态和贴壁能力都很好。

（2）细胞实验或传代中，密度大概50%~70%。这个细胞贴壁能力不好，前期实验中我们用的冻存细胞种子，一滴培养液就会飘，（然后我决定，就在一个地方滴加培养液，导致一皿细胞，有一个光秃秃的洞，反正就算是最小损失了）

准备转染：

（1）Polyethylenimine Linear, MW 25000 (PEI 25K) 线性化聚乙烯亚胺PEI 25000。

将100 mg粉末溶于100 mL去离子水中。 在搅拌的同时，缓慢加入盐酸使pH<2.0，固体溶解均匀，盐酸/氢氧化钠调节pH至7.0，室温静置20min后，再次调节pH至7.0，分装冻存于-80℃。使用前可将等分试样解冻，并在4℃下保存。解冻的等分试样应在1-2个月后丢弃。

前期我们用了lipo2000 ，转染效率挺好的，但是太贵了，就改为PEI了，效果也挺好的。

（2）     25 mM氯喹二磷酸酯：

将0.129 g氯喹二磷酸盐溶于10 mL无菌水中。过滤器通过0.22μm PES 过滤器灭菌。 分装储存在-20℃。使用前可将等分试样解冻，并在4℃下保存。 解冻的等分试样应在1-2个月后丢弃。

转染：

第一天：接种293T细胞。

在10 cm培养皿上接种380万293T细胞。

第二天(pm )：转染包装细胞。

细胞培养过液，第二天上午进行氯喹孵育。

（1） 10 mL新鲜的DMEM（含血清），添加10μL25 mM氯喹二磷酸酯，37℃孵育5h。一定要用氯喹孵育，不然效率很低。。。

（2）准备3种转染质粒的混合物，比例如下：我们使用的培养液是optipro-MEM，这两种培养液都可以的，注意，只是培养液，不加血清哟。

（3）准备PEI溶液

建议提前摸索一下PEI与DNA的质量比例，我筛选了1:1~5,1:1,1:2的效率太低了，1:4有少量细胞死亡，1:5细胞就死亡过多了，所以我使用的比例是1：3。

一般是先取500μL的optipro-MEM溶解稀释PEI，然后再将PEI稀释液加入到DNA里，不建议直接加PEI母液到DNA里，会导致吸附不均匀，最后会影响转染效率。轻轻颠倒数次，室温静置15min。静置时间不要超过15min~，宁少勿多。

（4）静置结束，直接将混合液滴加到培养皿中，培养皿放回培养即可。

第三天(am)：转染后18h。去除培养液，更换新鲜培养液。不要转染时间过久哟，细胞会被毒死。

第四天-第五天 ( am )：收获病毒。慢病毒表达会比较慢，一般是转染后48，72，96小时收取。转染后第3天细胞已经密度过高了，我一般收取2次。

如果此时，转染后第3天，你的细胞形态正常，也没有太多的死亡，基本呈现90~95%的密度，恭喜你，你的稳转株成功了，可以收取细胞，进行传代或冻存啦。

病毒上清可以暂时保存在4℃里，两次混合，之后1000rpm离心，使用0.45μm PES 过滤器过滤，保存于-80摄氏度中。

以上就是慢病毒包装制备的过程。

附图为我转染48h时的图，总结下来，难度不大，注意细节就能成功啦，祝大家实验顺利~