病毒扩增实验步骤

1.    用T75细胞培养瓶培养BHK-21幼仓鼠肾细胞，当细胞密度达到80%-90%，弃掉原培养液，PBS润洗（1-3次），加入500uL病毒原液和5mLDMEM。

知识点：MOI感染复数（代号m）是进行烈性噬菌体侵染试验的一个重要指标，m值为单个宿主细菌细胞感染的噬菌体颗粒数，它等于试验时所用的噬菌体与细菌的数量比例，即：

m=噬菌体颗粒数/宿主细菌细胞数

许多试验表明，当m值>1000时，宿主细胞常因噬菌体的过度侵染而死亡，以致难于实现噬菌体的复制和扩增。因此，通常在制备、扩增或保存噬菌体裂解液时，应将m值控制在2—5之间。进行噬菌体杂交试验时，m值以5—10为宜。测定噬菌体的一步生长曲线或裂解液效价时，m值应更低，通常为10^-6数量级。

2.    在细胞培养箱内培养2h,每隔15min轻轻晃动培养瓶。

3.    ２ｈ后，每个培养瓶中加入5mL细胞维持培养液（4%FBS）DMEM，后加入2%FBS DMED培养液。

4.    每隔12h观察细胞状态。一般2-4天可以出现CPE即可收取病毒液。当75%细胞出现CPE即可收取病毒液。

5.    将细胞培养瓶放入-80℃冷冻，常温解冻。冷冻15min,解冻10min。反复2次

解冻时晃动培养瓶，机械破碎细胞。最后一次解冻，在安全柜内，将所有病毒液转移至50mL离心管内（4000rpm,4℃离心，15min）。

6.    收集上清液至新的离心管中，充分混匀，用EP管进行分装，置于-80℃进行保存。