HBMEC细胞的OGD/R模型失败

实验步骤：

1、接种细胞：待皿中的细胞密度达到80%-90%，胰酶消化，细胞专用培养基ECM完全培养基终止消化，收集至离心管中，1000rpm，离心5分钟，弃上清，重悬混匀，得细胞母液。细胞计数，调整细胞浓度为2.5x104个/ml，100ul/孔种于96孔中，放于37度CO2培养箱中。

2、OGD损伤时间为0、3、6、9、12  单位（小时）

3、分组：正常组（0）、模型组（3、6、9、 12）

4、待96孔板中的细胞长至80%-90%,弃原培养液，正常组用DPBS清洗三遍，加入100ul/孔ECM完全培养基；模型组用DPBS清洗三遍，加入无糖DMEM培养基，加入100ul/孔无糖DMEM培养基。

5、打开MC-101缺氧小室，将完整的96孔板（没有弃去盖子），放入小室，检查封口是否平整，扣上扣件。打开进气管和出气管，以20L/min的流速放气五分钟，最后三十秒调至10L/min的流速，关闭出气孔。以10L/min的流速大概10秒钟左右，流量计中的珠子从10降至0，一动不动，表示缺氧小室气体已满，关闭进气孔，随后关掉阀门，喷洒酒精，放入培养箱，按照规定时间拿出。

6.取出符合时间的96孔板，弃去96孔中的培养液加入ECM完全培养，再加入20ul/孔的MTS，放入细胞培养箱孵育2小时，用酶标仪检测。

问题1：经过以下时间的缺糖缺氧，细胞没有损伤，怀疑小室氧气浓度没有降至1%左右，没有造成缺氧情况。

问题2：打开小室，打开管子，有气体冲出，是否可以排除漏气的原因。

问题3：原培养基(细胞专用培养基)不能完全去除，是否会有影响。

多谢指导！