【文献精读】新皮层和海马体结构形成的转录组细胞类型分类

英文题目：A taxonomy of transcriptomic cell types across the isocortex and hippocampal formation

中文题目：新皮层和海马体结构形成的转录组细胞类型分类

期刊：Cell     影响因子：41.6     发表时间：2021.5.17

文章摘要

哺乳动物大脑中的新皮层和海马体 (HPF) 在感知、认知、情绪和学习中起着关键作用。研究分析了覆盖整个成年小鼠新皮层和 HPF 的约 130 万个细胞，并得出了一个转录组细胞类型分类法，揭示了谷氨酸能和 GABA 能神经元类型的细胞综合库。与 HPF 具有更简单的细胞组织的传统观点相反，研究在 HPF 中发现了一群与具有六层结构的新皮层相同的谷氨酸能神经元细胞亚型，提示 HPF 和新皮层共享一个环路构筑模式。研究还确定了沿新皮层深度、跨新皮层的表面，以及海马和下叶突多个维度的细胞类型的大规模连续和分级变化。总体而言，研究建立了哺乳动物新皮层和海马形成的分子结构，并开始阐明其与这两种大脑结构的发育、进化、连通性和功能的潜在关系。

01

研究背景

大脑皮层占据哺乳动物大脑的很大一部分并执行多种功能，从感官知觉和自主行为的产生到情感、认知、学习和记忆。皮层被划分为多个区域，具有与许多皮层下和其他皮层区域的特定输入和输出连接。在发育过程中，皮质起源于端脑（telecephalon）的大脑皮层（pallium），在发育过程中，大脑皮质的内侧皮层发育成了海马结构（也成为古脑皮层，archicortex），腹侧皮层发育成了嗅皮层（也称为原脑皮层，paleocortex），背侧皮层则发育成了新皮层（也称同型皮层，neocortex/isocortex）。原皮层和古皮层被认为是进化上较古老的结构，而新皮层出现较晚，并在脊椎动物进化中显著扩大，在哺乳动物中达到目前的形式，普遍认为原皮层和古皮层神经元是排列为3-5 层，新皮层为 6 层。

新皮层的功能区域（人类 180 个，小鼠 30 个）以片状结构分布于皮层，包括所有感觉模式的初级和高级感觉区域，初级和次级运动区域，以及新皮层的额叶、内侧和外侧部分的多个关联区域，共同形成了一个分层神经网络，具有功能不同的模块以及模块内部和模块之间的前馈和反馈通路。海马结构 (HPF) 也是一个复杂的多区域结构，主要负责学习、记忆、空间导航和情绪调节（HPF 的背腹轴网络调控）。

不论是何种皮层，都主要包括谷氨酸能兴奋性（glutamatergic excitatory）神经元和氨基丁酸能抑制性（GABAergic inhibitory）神经元两大类，前者主要负责长距离投射构成层级网络，后者则主要负责调节小范围内神经元的放电和连接。

已有研究证明使用高度可扩展的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）方法生成全面的细胞类型普查可作为进一步研究大脑回路结构和功能的基础且有效的力量。美国艾伦脑科学研究所Hongkui Zeng团队利用两个不同的单细胞转录组测序平台（10x 和 SMART-Seq），测序了覆盖整个成年小鼠新皮层和海马结构的超过130万个细胞，开发了一种共识聚类方法来组合两个数据集，并得出一个细胞类型分类法，包括 388 种转录组类型，其中 364 种是神经元类型，完成了对跨新皮层和海马形成的转录组细胞类型分类，实现了在没有显著差距的情况下定义整个空间景观中的神经元细胞类型组成。

02

研究结果

2.1 转录组细胞类型分类法的形成

为了对细胞类型进行大规模单细胞转录组学表征，本研究开发了转录组细胞类型分类法，使用了两种互补的单细胞测序方法：SMART-Seq v4 (SSv4)和 10x Genomics Chromium (10xv2)平台。首先，通过分析和解剖边界的大脑区域，并在覆盖新皮层 (isocortex，CTX) 和 海马结构 (HPF) 的所有区域的中间本体级别采样（图1A)。 CTX 涵盖的区域：额极 (FRP)、初级运动 (MOp)、次级运动 (MOs)、初级体感 (SSp)、其他感觉皮层 (SSs)、味觉 (GU)、内脏 (VISC)、听觉 (AUD) )、初级视觉(VISp)、前外侧视觉(VISal)、前内侧视觉(VISam)、侧视觉(VISl)、后外侧视觉(VISpl)、后内侧(VISpm)、外侧中间(VISli)、后鼻(VISpor)、前扣带回( ACA)、边缘前 (PL)、边缘下 (ILA)、眶下 (ORB)、岛状颗粒 (AI)、脾后 (RSP)、后顶叶联合 (PTLp)、颞联合 (TEa)、周围 (PERI)和外鼻 (ECT) 区域。 HPF 的覆盖区域分为两个主要部分：海马区 (HIP)，包括 CA1、CA2、CA3 和齿状回 (DG)，以及海马后区 (RHP)，包括外侧内嗅区 (ENT1)、内侧内嗅区 (ENTm)、副下颌骨 (PAR)、下颌骨后 (POST)、下颌骨前 (PRE)、下颌骨 (SUB) 和前下颌骨 (ProS)。 HPF 中剩下的少数几个小区域，即片状灰质 (FC)、灰板 (IG)、海马 - 杏仁核过渡区 (HATA) 和区域前列腺 (APr)，都包括在其相邻区域的解剖中。

研究通过荧光激活细胞分选 (FACS) 进行细胞分离以富集神经元，获得质控后的 1,228,636 个单细胞 （10xv2 转录组）和 76,381 个单细胞 （SSv4 转录组）。首先分别对 10xv2 和 SSv4 细胞进行聚类，从而产生 332 个 10xv2 聚类和 324 个 SSv4 聚类。 10xv2 和 SSv4 数据集的综合聚类产生了 388 个共识聚类（图 1B）。尽管两个平台的基因检测存在很大差异（SSv4 为每个细胞 8,894 ± 1,551 个基因，10xv2 每个细胞为 4,125 ± 1,176，平均值 ± 标准差），但在这两种方法中每个聚类级别检测到的基因数量之间存在良好的相关性。作者通过转录组聚类的分层聚类构建了一个分类树（图 1B），该聚类是基于每个聚类的 5,981 个差异表达（DE）基因的平均基因表达得到的。然后使用统一流形近似和投影 (UMAP) 和星座图（图 1C-1E）可视化属于它们的细胞来探索 388 个集群之间的关系。这些探索细胞类型景观的不同方法，是离散和连续基因表达变异的组合，提供了对分类的整体描述。分类树很简单，但人为地离散：它们不保留类型之间的所有多维关系，但它们突出了主要的层次关系。UMAP 和星座图除了离散性之外，还可以实现连续性的可视化。有了这个基础，研究将分类法中的单元格集从粗到细的类别标记为：类（class）、邻域(neighborhood)、子类(subclass)、超类型(supertype)和类型(type)（图 1B）。

为了注释这个包含许多新转录组类型的分类法，研究整理了对分类法的每个簇和每个分支有选择性的 DE 基因集，以代表不同的粒度水平，并使用Lein 等人研究的 Allen Brain Atlas (ABA) RNA 检查它们的解剖表达模式原位杂交 (ISH) 数据。基于这种解剖（区域和层流）注释和先验知识，研究将 388 个集群分配到 4 个类、8 个邻域、42 个子类和 101 个超类型。 GABA能神经元类包含 6 个子类和 119 个簇；谷氨酸能神经元类包含 28 个子类和 241 个簇；星形胶质细胞/少突胶质细胞非神经元类包含 2 个亚类和 14 个簇；免疫/血管非神经元类包含 4 个子类和 10 个簇（图 1B）。研究将子类分为 8 个邻域，2 个 GABA 能（CGE 和 MGE），5 个谷氨酸能（L2/3 IT、L4/5/6 IT Car3、PT、NP/CT/L6b 和 DG/SUB/CA）和一个“其他”区。神经元邻域的详细分析在下面的部分中介绍。这里简要提到的“其他”区包括所有非神经元亚类，以及两个神经元亚类，Cajal-Retzius (CR)（谷氨酸能，主要在第 1 层）和 Meis2（GABAergic，主要在白质中）（图 1B)。 Meis2 神经元被鉴定为与嗅球中间神经元有关。由于本研究的重点是神经元细胞类型，因此研究对非神经元细胞的采样有限（QC 后 15,241 个 10xv2 细胞和 1,828 个 SSv4 细胞），不进行后续的重点分析。

图1.新皮层和HPF转录组学细胞类型分类。

(A) Allen CCFv3 中呈现的采样大脑区域的概述。 PPP-SP 联合区域包括 PAR-POST-PRE-SUB-ProS。

(B) 由 388 个簇组成的转录组分类树，以树状图表现（10xv2：n = 1,169,213；SSv4：n = 73,346）。 条形图表示根据平台、性别和区域分析的细胞分数，以及 log10 尺度上每个簇的细胞总数。

(C) 谷氨酸能类型之间全局相关性的星座图。 每个集群由一个点表示，位于 (D) 中所示的 UMAP 坐标中的集群质心处。 集群按子类分组。 80% 以上的细胞来自 HPF 的簇被标记为绿色。

(D 和 E) 由簇 (D) 或区域 (E) 着色的谷氨酸能类型的 UMAP 表示。

2.2 GABA能细胞类型分类

 GABA能抑制性神经元类别可分为两个与不同发育起源相关的邻域：尾神经节隆起（CGE）（图2A-2E）和内侧神经节隆起（MGE）（图2F-2J）。值得注意的是，某些 CGE 细胞类型（例如，某些神经胶质细胞）实际上可能是从附近的视前区 (PO) 发育而来的。每个邻域进一步分为 3 个子类：CGE 中的 Lamp5、Sncg 和 Vip ， MGE 中的 Sst Chodl、Sst 和 Pvalb。在 CGE 邻域中，Lamp5（主要是神经胶质细胞）、Sncg 和 Vip 子类分为 4 个、5 个和 6 个超类型（图 2D）。在 MGE 邻域中，Sst Chodl 子类保留为一组（代表远程投影 Sst 细胞）； Sst 和 Pvalb 亚类分别分为 11 和 3 个超类型（图 2I）。当前的 CTX-HPF GABA能细胞在超类型水平上与先前研究中的源自皮质区域 VISp-ALM和 MOp 的转录组分类法基本一致。如点图（图 2A 和 2F）和 UMAP（图 2C 和 2H）所示，所有新皮层区域 GABA 能神经元类型都与 HFP海马结构的 GABA 能神经元类型共享，包括 RHP 区域。同时，研究还观察到一组特定于或高度富集 HPF 的集群，其中包括 Lamp5 Lhx6、Ntng1 HPF、Vip Cbln4 HPF、Sst Lmo1 HPF 和 Sst Ctsc HPF 超类型，以及共享超类型中的选择集群（图 2A、2D、2F 和 2I）。相反，一些簇在 HIP 中基本上不存在（例如，Lamp5 Pax6、Sst Syndig1l 和 Sst Hpse 超型），而其他簇都具有 CTX 或 HPF 选择性对应物（例如，CTX 中的 Sst Myh8 和 Sst Etv1 簇与 HPF 中的簇），GABA能中间神经元类型组成的最大区别在于 CTX 和 HIP 本身之间； RHP 区域通常同时包含 CTX 和 HIP 簇，只有少数例外。

对于 CGE，Ntng1 HPF 超亚型并不广泛表达 CGE 标记基因 Prox1或其他子标记基因 Vip、Sncg 或 Lamp5（图 2A）。 HIP 中的 Ntng1+ 细胞可见于辐射层/腔隙层-分子边界（图 2E），可能是投射到 RSP 的三层细胞或辐射-海马后神经元。 Lamp5 Lhx6 超型在 HIP 中比在皮层中丰富得多，并且可能源自 MGE 而不是 CGE；它的簇 5、8 和 9 是 HPF 特定的，并由 海马区（CA3区） 中的 Rxfp3 标记（图 2E）。超型 Vip Cbln4 HPF 中的簇 54 和 55 由 Qrfpr 标记，也在 CA3 中表达（图 2E）。

Sst 子类具有多个富含 HPF 的簇，其中大部分以 Npffr1 为标记。 Sst Ctsc HPF 是一种高度独特的 HPF 特异性超型；簇 102 和 103 由在 CA3 中表达的 Rxfp3 标记，而簇 104 和 105 由在 DG（DG-po，也称为 hilus）的多态层中表达的 Cxcr4 标记（图 2J）。 Cxcr4+ 细胞可能对应于先前描述的肺门高性能相关路径(HIPP) 或 DG 生长抑素表达中间神经元 (DG-SOMI)。研究还鉴定了具有独特标记 Ntf3 和 Sntb1 的 HIP 特异性 Pvalb 枝形吊灯细胞簇。

图2. 新皮层和HPF的GABA能神经元分类。

(A) CGE 簇的树状图，点图，显示来自 10xv2 数据集的每个解剖区域和每个簇中标记基因表达的每个簇内的细胞比例。 点的大小和颜色分别表示每个簇中表达细胞的比例和平均表达水平。

(B 和 C) CGE 集群的 UMAP 表示，按集群 (B) 或区域 (C) 着色。

(D) 使用 (B) 中显示的 UMAP 坐标的 CGE 群集的星座图。 簇按超类型分组。 80% 以上的细胞来自 HPF 的簇被标记为绿色。

(E) 来自 Allen Mouse Brain Atlas (ABA) 的 RNA ISH，用于在 HPF 特定 CGE 超型中表达的选择标记。

(F-J) 与 (A)-(E) 相同，但适用于 MGE 集群。

2.3 谷氨酸能兴奋性细胞类型分类法。

研究系统地鉴定了来自不同 HPF 区域的大量神经元类型和亚类，这些神经元类型和亚类与 CTX 中的神经元类型和亚类非常不同。同时，在分类树和 UMAP 中， HPF 和 CTX 细胞类型与新皮层神经元类型（特别是 L2/3 IT、L4/5/6 IT 和 NP/CT/L6b 邻域）间存在同源关系之间的差异（图 1B-1E）。尽管存在区域差异，但研究通过搜索 HPF 和 CTX 之间的基因表达协变进一步探索了这一点，并将每个 HPF 细胞的基因表达与每个 CTX 簇的平均表达相关联。选择与每个 HPF 集群相关性最高的 CTX 集群作为匹配项，并按 CTX 子类聚合匹配项排列（图 3A）。这种方法表明，大多数 HPF 细胞类型与特定的 CTX 亚类相匹配。然后研究计算了相关性最高的 HPF-CTX 簇对之间 DE 基因的数量，这可以表明该对的整体相关性或相似度（DE 基因越少，相关性越高）。 CTX NP、CT 和 L6b 亚类CTX L2/3、L4/5 和 L6 IT 子类与它们在 ENT、PPP 和 SUB 中的对应中具有最大的相似性（图 3A）。有趣的是，L3 IT ENT、L2 IT ENT1 和一些 L2/3 IT PPP 集群被映射到 L4/5 IT CTX。研究进一步发现了 SUB-ProS 和 HIP 细胞类型与新皮层细胞类型的相似之处。所有 SUB 和 ProS 集群都与 L5 PT CTX 最相关，集群 L5 PPP 263 也是如此（尽管距离更远）。

总体而言，这些相似之处与研究基于标记基因的 HPF 簇注释到相应层一致，并提供了相互确认。特别是，在 HPF 区域显示相似类型和层特异性的一大组典型新皮层细胞类型标记基因具有同源性，包括 L2/3/4 IT 类型的转录因子 Cux2 和 Lhx2、Fezf2、Pou3f1、Bcl6 L5 PT 及其相应的 SUB-ProS-CA1 类型的 Bcl11b 和 Etv1，以及 CT/NP/L6b 类型的 Tle4 和 Foxp2 所有 CTX 和 HPF 区域的谷氨酸能细胞类型的图形概要，基于以上和以下部分说明了所有超类型（以及每个超类型下的type类型）及其区域和层分布、潜在的投影模式以及 CTX 和 HPF 类型之间的同源关系（图 3B）。

图3. 新皮层和海马结构中谷氨酸能细胞类型的比较。

(A) HPF 簇与 CTX 亚类的对应关系，表示为总匹配的比例。下图显示了每个 HPF 簇与其最匹配的 CTX 簇之间差异表达基因的数量。

(B) CTX 和 HPF 中所有区域的谷氨酸能兴奋性细胞类型概述。细胞类型由超类型和每个超类型内的簇显示。 CTX 和 HPF 由实线分隔。每个 CTX 和 RHP 区域（但不是 HIP）中的细胞类型根据它们的层特异性从上到下显示。基于层特异性的相似性，来自 RHP 区域的细胞类型与来自 CTX 的细胞类型对齐。 IT 类型以粉红色椭圆形阴影，PT、NP、CT 和 L6b 类型带有淡黄色椭圆形，HIP 类型带有淡蓝色椭圆形。每个椭圆形跨越每个超类型中的细胞来自的主要区域。在 CTX 中，大多数超类型跨越所有领域。给定超类型中的一些集群表现出对一个或几个区域的偏好，这些集群显示为包含在较大超类型椭圆中的较小椭圆。具有相似投影模式（脑内、脑外/脑下或皮质丘脑）的细胞类型按大括号分组。

2.4 海马体结构和亚突区细胞类型分布的多维变异。

在 DG/SUB/CA 邻域中，DG、CA2 和 CA3 子类高度不同，而 SUB-ProS 和 CA1-ProS 子类更密切相关（图 4A-4D）。 在 CA3 亚类中，根据多种标记基因，包括 Gal、Rgs12、Glipr1、Necab1 和 Calb2（HPF 标记）确定了一个肺门苔藓细胞超型 Mossy Rgs12。

CA1、CA3 和 SUB 沿多个维度（浅表-深、近-远端和背腹）具有逐渐的基因表达和连接性变化。为了了解所有海马体区域和亚细胞群与这些区域的三维空间结构之间的关系（图 4E），研究使用 UMAP 和主成分分析（PCA）来评估CA/SUB 细胞类型之间的变异模式以及它们与先前描述的维度的相关性。

研究首先通过 CA1-ProS 和 SUB-ProS 亚类中所有细胞的一维 UMAP 提取一个驱动 CA1、ProS 和 SUB 变异的主轴，并发现该轴对应于近端-远端 (Pr-Di)从 CA1 到 SUB 的梯度，其中每个阶段的转变都由一组不同的基因驱动。为了检查其他变异轴，作者还利用主成分分别分析研究了 CA1 和CA3（不包括 Mossy Rgs12 超型）并发现顶部 PC 对应于背腹（Do-Ve）梯度（图 4F-4I）。作者进一步研究确定了一组核心基因，这些基因不仅在 CA1 和 CA3 中而且在 SUB/ProS 和 DG中指定了这种梯度，研究推测这可能是背腹梯度变化的核心部分。最后作者还对特定的基因进行了原位成像（图 4J）。

图4. 海马体结构和下叶突谷氨酸能细胞类型的多维分布。

(A 和 B) DG/SUB/CA 细胞类型的 UMAP 表示，按区域 (A) 或簇 (B) 着色。

(C) DG/SUB/CA 集群的星座图。 簇按超类型分组。

(D) DG/SUB/CA 集群的树状图，带有主要分支的注释。

(E) 3D 和 2D 示意图显示海马体结构和下丘内的空间轴：近端-远端 (Pr-Di)、浅表-深 (Su-De) 和背腹 (Do-Ve)。

(F) CA1中的细胞的 2D PCA 图。 PC1 对应于 Do-V 轴。 虚线显示假定的 Su-De 分离。

(G) 小提琴图显示 CA1 簇沿 Do-Ve、Su-De 和活动轴的分布。

(H 和 I) 与 (F) 和 (G) 相同，但适用于 CA3 细胞。

(J) Pr-Di、Do-Ve、Su-De 和 CA3、CA1、ProS 和 SUB 活性维度中细胞类型变异的总结。 每个圆圈代表一个集群，计算其单元成员沿四个维度中的每个维度的平均值。

2.5 贯穿新皮层区域的谷氨酸能神经元类型的连续变化

 研究分析了所有 CTX区域（即新皮层）的谷氨酸能神经元亚类（IT、PT、NP、CT 和 L6b）的区域分布特异性。这些子类中的几乎所有簇都包含来自多个新皮层区域的细胞。为了进一步研究跨区域变化并排除具有强区域特异性的细胞类型，研究为每个子类创建了一个单独的 UMAP（图 5A），（例如，L4 RSP-ACA Scnn1a、L5 PT Chrna6 和向 HPF 的过渡类型）。研究发现每个子类中的单个簇占据梯度图上的特定域，且相似的簇彼此靠近。为评估新皮层区域之间的全局关系，研究基于它们在每个子类中的平均基因表达谱构建了一个树状图，并连接到所有子类中（图 5B）。研究观察到基于树的以下分组：外侧和前额叶区域 TPE/AI/PL-ILA-ORB、内侧区域 RSP/ACA、运动区域 MOp 和 MOs，然后是所有感觉区域包括AUD、SSp、SSs-GU- VISC、PTLp 和 VIS，每个子类的所有区域的成对相关热图揭示了与树的一致模式，并再次将 TPE 和 RSP 显示为最不同的区域（图 5B）。然后，研究根据转录组评估了不同新皮层区域的可分离性（图 5C）。在大多数情况下，细胞被优先预测属于它们被解剖的区域，尤其是内侧、外侧和前额叶区域，远处区域之间几乎没有混淆，而相邻区域之间存在相当大的混淆，特别是对于感官区域。 L5 PT 和 L4/5 IT 的区域分离比其他子类更明显（图 5A）。研究还确定了有助于区域多样性的关键转录特征（图 5D 和 5E）。

图5. 新皮层中谷氨酸能细胞类型分布的区域梯度。

(A) 不同亚类中新皮层细胞的 UMAP 图。 顶部是等皮质区域的 2D 平面图表示，根据它们在 CCFv3 中的位置。

(B) 每个亚类皮质区域之间相关性的热图。 (B)–(D) 的顶部是根据每个子类中的平均基因表达生成的皮质区域的树状图，并连接到所有子类中。

(C) 每个子类的皮质区域可预测性的混淆矩阵。 行和列对应于细胞的实际和预测区域数值，行加起来为 1。

(D) 每个亚类的区域特异性标记基因的热图。 颜色对应于每个区域中表达给定基因的细胞分数。

(E) (D) 中标记基因的 RNA ISH （原位杂交成像），显示特定亚类的标记基因表达的区域分布。

03

研究意义

该研究对新皮层和海马结构中超过130万个细胞进行了单细胞测序分析，这样的规模几乎涵盖了所有新皮层和古脑皮层的结构。研究发现，新皮层区域和 HPF 中有许多新的细胞类型；新皮层中的所有 GABA 能神经元类型都与 HPF中的共享，并且 HPF 还包含其自身独有的其他 GABA 能神经元类型；新皮层和海马结构的兴奋性神经元细胞在分子构成上有很多相似之处，具有同源性（这种同源关系得到了两个共享分子特征的支持，包括经典转录因子和类似的特定层分布）；此外，新皮层和海马结构的细胞都在分布上呈现连续梯度变化。

研究揭示了整个新皮层和海马结构的分子组织结构，表明这两种主要大脑结构之间存在进化上保守的细胞和回路组织。这一成果为今后的脑科学的功能研究打下了基础。