激酶抑制剂活性测试第五章节-生化检测方法详细介绍（二）

1 均相非放射性法

上述这些非均相的方法，存在操作繁多的问题。随着技术的发展，越来越多的均相非放射性方法开始被应用于激酶活性的检测之中，根据实验原理的不同，可以分为检测ATP的量、检测ADP的量、检测带标记或修饰的多肽底物、配体激酶结合法等。

1.1 检测剩余的ATP的量

有些方法可以利用测定激酶反应中未被消耗掉的ATP量来检测酶活，例如Promega公司的Kinase-Glo™技术。该方法利用激酶反应后剩余的ATP，将荧光素转化为氧化荧光素，并发出化学冷光，荧光信号值与激酶活性成反比。该试剂盒里的重组热稳定荧光素酶(Ultra-GloTM)，发出稳定的“辉光”型荧光，半衰期大于5个小时，不需要配套进样器的荧光仪，可成批处理大量的微孔板。Ultra-GloTM发出的稳定荧光可适用于多种检测条件，与特定的缓冲液组成相搭配，可减少来自化合物的自发荧光的干扰。

该检测方法的成本很低，但为了产生大于2倍的信噪比，至少需要50%的转化率，因此不能用于进行激酶性质的研究，但在ATP产生50%~80%转化率的时候，抑制剂的活性的偏移在2到3倍之间，处于可以接受的范围，因此该方法可适用于抑制剂的高通量筛选。

1.2 检测ADP的生成量

该类方法较易检测一些非多肽底物的激酶活性，如脂激酶，同时也可以测定一些ATP酶的活性。该类方法又可以分为ADP偶联反应，即将ADP转化成其他物质并进行检测，例如Promega的ADPGloTM；依靠ADP抗体检测的方法，例如Invitrogen的Adapta®，Cisbio的Transcreener®等方法；

1.2.1 ADP-GloTM

ADP-Glo™(原理见图1)是Promega公司开发的一种发光法激酶检测方式，检测激酶反应中所形成的ADP的量来反应激酶活性。在该检测方法中，激酶反应中剩余的ATP会首先被ADP-Glo试剂消耗掉；接下来，激酶反应中生成的ADP则会被激酶检测试剂还原成ATP；然后，ATP在Ultra-Glo™萤光素酶的作用下，与荧光素反应发光，发光信号与激酶活性正相关。ADP-Glo™可用于检测几乎任何可生成ADP的酶的活性，不需要抗体参与以及放射性标记。这种检测方法相当敏感，能够检测到的ADP的浓度下限为20 nM。Liu等利用ADP-GloTM技术筛选得到了CK2的抑制剂香豆雌酚，并分析了抑制剂的机制。

1.2.2 其他检测ADP生成量的方法

除了Promega公司的ADP-GloTM以外，很多其他公司也开发了类似检测方法，譬如DiscoveRx公司的ADP Hunter™、Cisbio公司的Transcreener™以及Life technologies公司的Adapta™。其中ADP Hunter™可以利用激酶反应中产生的ADP，将烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)转化为丙酮酸(pyruvate)，并最终转化为荧光信号。该方法可以实时监测激酶的活性变化。而Transcreener™和Adapta™则是在ADP的特异性单克隆抗体上标记铕(Eu)原子，同时再使用d2或者AlexaFluour647等荧光分子标记的ADP来竞争激酶反应的产物ADP，用于检测ADP的生成量。

1.2.3 检测ADP生成量的方法的优缺点

这些检测ADP的方法，其优点在于：(1)检测产物而非底物，因此灵敏度要远远高于检测ATP消耗量的Kinase-Glo™；(2)不仅可以应用于蛋白激酶的活性检测，同时糖激酶、脂激酶、ATP酶也可以使用此类方法进行活性测定；(3)由于很多激酶本身有内在ATP酶的活性，因此在反应体系中可以考虑不使用多肽底物，从而降低成本。当然，这些方法也有一些相对不足之处，如易受到ATP酶活性的干扰，不能测定活细胞内激酶的活性等。

1.3 检测带标记或者修饰的多肽产物

虽然上述方法可以检测激酶活性，但更多的公司选择对多肽底物进行各种修饰，并应用荧光技术进行检测，如荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP)、荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)、时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)等方法。

1.3.1 荧光偏振(Fluorescence Polarization, FP)

荧光偏振技术是一种监测分子转动的技术，其原理是物质分子量的大小决定了该物质的运动和转动速度，质量越大，则转动速度和角度越小，当使用偏振光进行激发时，所获得的偏振光的角度也有所不同。荧光偏振的定义公式为P=(III - I⊥)/(III + I⊥)。其中III表示发射光和激发光平行时的荧光强度，而I⊥则表示发射光和激发光垂直时的荧光强度。荧光偏振不依赖于激发光的强度或者荧光素的浓度。当荧光素自由旋转时，其偏转角度是一个很小的数字，我们称之谓低荧光偏振；而当荧光素和其他大分子结合后，其偏转角度增大，我们称之谓高荧光偏振。

很多公司开发了相应的试剂盒，包括Bell-Brook公司的Transcreener ® FP，DiscoveRx公司的HitHunter™，Millipore公司的KinEASE™ FP，以及Molecular Devices公司的IMAP™ FP等等。荧光偏振的优点在于成本较低，均相的反应较易应用于高通量筛选；然而，由于很多因素会导致荧光分子转动速度的变化，因此有一些假阳性和假阴性的结果无法避免。

1.3.2 荧光共轭能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

荧光共轭能量转移是一种能实现完全自动化激酶活性检测方法。该方法将“受体”荧光分子和“供体”荧光分子连接在一起，当“供体”荧光分子受到激发时，能将非放射性的能量转移到“受体”荧光分子上，并发生荧光信号。市场上的相关产品众多，譬如Life Technologies公司的Z’-LYTE™以及PerkinElmer公司的AlphaScreen®等。

以Z’-LYTETM方法为例，其原理是磷酸化对多肽底物的保护作用(原理见图2)。首先，在多肽底物的N端以及C端，分别标记上“供体”荧光分子香豆素和“受体”荧光分子荧光素，这两种荧光分子的发射光谱分别为445 nm和520 nm。如果多肽底物在激酶反应中被磷酸化，就不容易受到蛋白水解酶的水解，FRET依然存在；相反，若激酶反应体系的多肽底物没有被磷酸化,未磷酸化的多肽底物会被蛋白水解酶降解，FRET不复存在。我们可以使用445 nm和520 nm的荧光强度的比率高低(S445/S520)来表示其磷酸化程度：比率越低，则多肽底物的磷酸化程度越高；反之，比率越高，则多肽底物的磷酸化程度越低。Deng等利用该方法得到抑制剂DC120对AKT的EC50值为153 nM。Z-LYTETM检测方法的优点是：(1)信噪比高，读数稳定，操作简单，便于高通量化；(2)无需抗体，试剂价格相对便宜。但此类方法也有明显的缺点：(1)容易受到蛋白水解酶的影响，无法测定多肽底物的一些相关参数，如多肽的 Km值，也不能进行一些较为复杂的抑制剂机制实验；(2)如果化合物本身有很强的自发荧光，尤其在高浓度(如10 μM)时，会对结果造成很大的影响，必须经过荧光校正；(3)如果化合物有蛋白水解酶的抑制性，就会产生假阳性的结果。

1.3.3 时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence resonance energy transfer, TR-FRET)

时间分辨荧光使用衰减时间较长的荧光分子，如铕(Eu)、钐(II)、铽(Tb)等镧系元素，并在激发一段时间以后再对荧光数值进行检测。时间分辨荧光往往需要采用结合磷酸化多肽底物的单克隆抗体。现有的检测方法有Cisbio公司的HTRF®技术，Life Technologies公司的LanthaScreen®技术以及PerkinElmer公司的Lance®技术等。上述方法将铕(或者铽)标记于多肽底物的单克隆抗体上，作为“供体”荧光分子，铕的发射光为620 nm左右(铽为480nm左右)；而在多肽底物上标记“受体”荧光分子，铕对应“受体”的发射光为665 nm左右(铽对应“受体”的发射光为520 nm左右)。当多肽底物被磷酸化时，就能够和抗体结合，从而发生能量转移，能够被读取时间分辨荧光的设备所识别。以HTRF®为例，它是均相时间分辨荧光技术的简称(原理见图3)，对TR-FRET技术进行改进，提高了灵敏度和稳定性。通常人们将铕原子和抗体螯合在一起，但这种螯合相对并不稳定，容易受到一些络合剂的影响，如EDTA；而在终止激酶反应时，恰恰需要加入高浓度的EDTA。HTRF®技术使用一种穴状化合物来和铕提供更加稳固的结合，从而避免了铕原子脱落的风险。Htrf是目前应用较广泛的技术，除了用于蛋白激酶抑制剂的筛选外，也可用于研究蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction, PPI)的抑制剂，可溶性蛋白质的量及信号通路相关蛋白的研究。Nørskov-Lauritsen]等用条件优化后的Htrf方法研究钙离子敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR,CaSR)的信号通路，可对细胞里的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、肌醇-1-磷酸(D-myo-inositol 1-phosphate, IP1)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase 1/2, ERK1/2)定量检测，从而研究CaSR参与调节的多条信号通路的激活状态。

以上TR-FRET与抗体技术相结合的检测方法，优点主要有：(1)抗体具有选择性，特异性强，信噪比高；(2)很好的避免了化合物本身的自发荧光对实验的干扰；(3)荧光信号稳定时间更长，无需立即检测。(4)均相反应，易于高通量化。当然，也有以下缺点：(1)特异性单克隆抗体本身比较昂贵；(2)并非所有的磷酸化多肽底物都有现成的抗体。

1.3.4 迁移率改变法(Mobility Shift Assay)

激酶反应后，部分底物被激酶加上磷酸基团成为产物，因此底物和产物之间相差3个电荷。迁移率改变法就是利用这种差别，使用毛细管电泳将底物和产物分离检测。PerkinElmer的设备Caliper，可以将痕量的激酶反应液转入微流体芯片中，并进行检测(原理见图4)。

应用迁移率改变法检测，首先需要在多肽底物的N端接上FAM或者其他荧光标记，并在微孔板中进行酶学反应；同时，吸样针能够将痕量的酶反应液吸入检测芯片内部。由于芯片中分离管路上被施加了电压，带有荧光标记的多肽底物和反应产物由于电荷的不同被分离，然后在检测窗口进行信号的激发和检测。在检测每一个样品时，都可以同时看到底物和产物的信号。通过多肽产物以及多肽底物的峰高比较计算，就可以获知实际转化率。

迁移率改变法其优点是可以在不加入中止试剂的情况下，实时监测酶学实验。这样研究酶学性质，尤其是需要动态检测的一些实验，如化合物缓慢结合，不可逆结合测试等变得非常简便。但由于其检测速度较慢——一块384孔板在4针芯片上需要运行大约2~3小时，使得其在药物高通量筛选上的应用，受到很大的限制。

1.4 配体激酶结合检测法

在高通量筛选以及激酶酶谱筛选中，使用激酶活性检测占到了绝对主导地位。然而，我们也可以通过监测激酶和底物结合的情况，用于先导化合物的结构优化，尤其是当纯化获得的激酶基础活性较低或者未知其生化活性时。目前市场上流行的此类方法有Life Technologies公司的LanthaScreen® Eu Kinase Binding以及Ambit公司的KinomeScanTM。

以LanthaScreen® Eu Kinase Binding为例，其主要原理是使用荧光标记的星型孢菌素(Staurosporine, SSP)或者其他ATP类似物(原理见图5)。首先在表达蛋白激酶时，增加一个小“尾巴”，譬如说GST或者6个His等等。同时，我们需要找到此类“尾巴”的特异性单克隆抗体，并用Eu修饰该抗体。这样检测体系包含有荧光标记的ATP类似物，带“尾巴”的蛋白激酶以及Eu标记的针对“尾巴”的抗体。其中，Eu标记的抗体能和带“尾巴”的蛋白激酶结合，而荧光标记的ATP类似物，则能够结合到激酶的ATP结合位点，就能产生TRHTRFFRET。但如果检测体系中包含有蛋白激酶的抑制剂，抑制剂就会取代荧光标记的ATP类似物的位置，从而使TR-FRET降低。

配体激酶结合检测法的优点在于：(1)能够检测低活性甚至无活性蛋白激酶，或者一些尚未知晓其生化活性的蛋白激酶；(2)不需要考虑酶促反应的一些限制，操作非常简单；(3)可以实时监测激酶和化合物的解离或者结合情况。但其缺点在于：(1)无法获知激酶的具体活性高低；(2)无法对一些非ATP竞争型抑制的化合物进行筛选或评价。

2 激酶酶谱筛选和激酶筛选方法的展望

虽然多个激酶抑制剂已经被FDA批准，作为药物进行临床治疗，但在治疗过程中也暴露出不少问题。其中，有一个重要问题就是所谓的“脱靶效应”，即抑制剂除了靶向激酶以外，还会同时抑制其他一些非靶向激酶，并有可能引起一些细胞毒性反应。因此，必须在激酶抑制剂改造研究的前期，就增加激酶酶谱筛选(kinase profiling)。

激酶酶谱筛选即检测一种结构的抑制剂对一系列激酶的抑制剂性大小，目的是为了得到具有较好选择性的抑制剂。目前多家公司均提供了激酶酶谱筛选的服务，如LifeTechnologies公司的SelectScreen®激酶筛选平台，有超过400种激酶可供检测，可提供检测方法有Z’-LYTETM、Adapta®和LanthaScreen®Eu Kinase Binding等；DiscoveRX公司的KINOMEscan®利用检测激酶和底物结合程度的方法可筛选的激酶种类超过460种。但同时，没有任何一种检测方法能够检测所有激酶的活性，必须使用两种以上的方法组合并进行相对应的评判。在此过程中，由于不同检测方法使用的激酶量、ATP浓度、缓冲液成分、反应温度、时间等都有所不同，因此，如何正确看待不同方法间的抑制率的关系是一个亟待解决的问题。

迄今为止，已经涌现了如此众多的激酶检测方法，相信今后会有更多地方法加入其中。即使如此，由于人体激酶谱的复杂性，很难有能够适用于所有激酶检测或者适用于所有研究阶段的方法。因此，必须根据实际需要来进行相应的选择：(1)对于高通量筛选(high throughput screening, HTS)，应该尽量挑选价格便宜且信号窗口比较大的方法，同时速度快，易于操作。(2)对于化合物优化设计阶段，应选择激酶使用量比较低的检测方法，这样检测限度也会比较低。(3)在药物设计中后期，必须要使用激酶酶谱进行筛选，以判断是否有“脱靶效应”。(4)对于将要进入临床测试检验的候选化合物，要使用“金标准”放射性同位素方法进行确证。

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