杂交瘤细胞测序怎么做?
分享一下杂交瘤细胞测序的主要流程
单抗杂交瘤总RNA的提取
复苏杂交瘤细胞株后培养,待细胞长至对数生长期,细胞计数约 8×107时,离心,5min后收集细胞。实验开始前,将实验用的*头烧杯等仪器浸泡于DEPC 溶液, 除去RNA 酶,高温灭菌后烘干。超净工作台环境下,用试剂盒提取细胞总RNA,-80℃保存。
第一链cDNA合成
提取杂交瘤总RNA后,利用3’RACE技术与5’RACE技术, RT-PCR得到与全长mRNA互补的第一链cDNA,引物为帽子结合引物。
可变区基因扩增与纯化
以合成的cDNA 作为模板,设计并合成 VH和VL的上下游引物,PCR 扩增VL与VH基因。分别取VH和VL基因的 PCR 产物各20μl进行电泳,采用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒,切下目的条带,纯化后回收目的条带。
载体构建
将目的基因片段和T载体连接。连接体系(10μl):10×T4 连接buffer 2μl,T4连接酶 1μl,VH或 VL基因片段3μl,T载体质粒 DNA 1μl(1:3-1:8),ddH2O 3μl,16℃连接 3小时后进行下一步。
转化与质粒抽提
双酶切鉴定
测序
更多技术内容可以参考http://www.merrybio.com.cn/services/hybridoma-gene-sequencing.html
以及http://www.merrybio.com.cn/blog/hybridoma-cell-sequencing.html等