小鼠各脑区神经元形态学观察及其HIF-1α和PHD的表达检测

小鼠用0.4%的戊巴比妥钠行腹腔麻醉，麻醉剂起效后，将小鼠固定于灌流台上并迅速打开胸腔，经左心室迅速灌入37ºC的生理盐水50ml，剪开右心耳，继之灌入4ºC的4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4) 50ml进行固定，取脑修块，并放入同浓度固定液中后固定2个小时，随后用0.01M的PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗脑中残留的固定液，每1h一次，共6次。梯度酒精脱水（75%、80%、95%及100%的酒精）、二甲苯透明、浸蜡、包埋后行冠状切片（片厚5 μm）。切片分成两套，一套用于常规的组织学苏木素-伊红（HE）染色，另一套用于免疫组织化学（SABC法）染色。37ºC恒温箱中烤片过夜，切片紧密粘附后备用。

  常规苏木素-伊红染色（HE染色）。脱蜡（切片浸入二甲苯两次，各5min）→ 复水（依次浸入梯度乙醇100%，95%，90%，80%，70%各2 min，蒸馏水 5 min）→ 染色（浸入苏木素染色液20 min）→ 自来水冲5min→ 分化（1%盐酸酒精溶液15秒）→ 返蓝（流水冲洗15 min）→ 0.5%伊红复染（2min）→ 脱水（70%酒精数秒后，80%、90%、95%、100%酒精各1 min）→ 透明（二甲苯两次， 各1 min ）→ 封片→ 光学显微镜下观察。

免疫组织化学（Immunohistochemistry）染色。采用链球菌抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物即SABC法检测HIF-1α和PHD在海马的CA1区、CA3区及DG和前额叶皮层的表达。采用0.02M的PBS替代一抗作阴性对照。常规脱蜡（二甲苯I、II，各5min）→ 复水（梯度乙醇100%，95%，90%，80%，70%各2min，蒸馏水5 min）→ 0.02MPBS洗3次，各5min→3 %过氧化氢水溶液室温浸泡10min，蒸馏水冲洗3次，各5 min→ 热抗原修复（浸入 0.01M PH6.0的枸橼酸盐缓冲液中煮沸修复10min，冷却10min再修复）→ PBS缓冲液冲洗3次共15min→ 滴加5%BSA封闭液室温20 min→ 滴加一抗（1：100稀释） 37℃湿盒孵育2h→ 0.02 MPBS洗3次，各4min→ 滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG， 37 ℃湿盒孵育20 min→ 0.02M PBS洗3次，各4 min→ 滴加SABC，37℃湿盒孵育20 min→ 0.02MPBS洗4次，各5 min→ DAB显色（室温避光，反应时间控制在5-30分钟）→ 流水冲洗10min，蒸馏水5min→ 脱水（依次浸入70%，80%，90%，95%，100%乙醇各2min）→ 透明（二甲苯I、II，各2min）→ 封片→ 显微镜观察

每只小鼠选取海马CA1区、CA3区及齿状回（DG）和前额叶皮层（PFC）切片各4张，每张随机选取两个视野，进行显微（×400）拍照。采用Motic Images Advanced 3.2 图像处理系统观察各脑区神经元形态学变化，分析测量各脑区阳性细胞的细胞数、平均光密度值和平均目标灰度值。计算4张切片各脑区每个指标的平均值。