免疫荧光常用方法步骤分享

石蜡切片免疫荧光单标实验步骤

1.  组织脱水

    75%酒精        4h

    85%酒精        2h

    90%酒精        1.5h

    95%酒精        1h

    无水乙醇Ⅰ     0.5h

    无水乙醇Ⅱ     0.5h

2.  组织透明

组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。

无水乙醇：二甲苯（1：1）    10min

二甲苯Ⅰ                    10min

二甲苯Ⅱ                    7min

3.  浸蜡

透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡。

石蜡Ⅰ（60℃）                   1h

石蜡Ⅱ（60℃）                   1h   

石蜡Ⅲ（60℃）                   1h

以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。

4.  包埋

包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。

5.  切片和烤片

切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上调节切片要求的厚度（一般为4微米），调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。

切好的切片必须贴附于载玻片上才能作进一步处理，但是切片常有细小的横纹，必须经展平后才能贴附，否则影响染色和观察。捞片法首先将连串的切片放入到42℃左右（视蜡的熔点而定，此温度适合熔点为59℃左右的石蜡）的温水浴展片锅中，这时切片都浮在水面上，由于表面张力的作用使切片自然展平，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃ 烤箱烤片3个小时即可。

6.  切片脱蜡

将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。

7.  抗原修复：我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

8.  血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。

9.  加一抗：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的切片上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。
10. 加荧光二抗： PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。

注意：此步骤及后面所有操作步骤都尽量在暗处进行。

11. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。

12. 用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。