BMDM消化的问题

我是用peprotech 的GM-CSF诱导的BMDM,一共诱导了好多波,好多次都完全消化不下来,不管是胰酶还是10mm EDTA,其中一波消化的特别特别好,细胞铺板10小时就又完全伸展了,形态也很好!后来连续两波又完全消化不下来!!!思来想去,诱导过程中唯一变的地方就是消化特别好的那一次,6孔板里面铺的是2ml/孔培养基,后来怕营养跟不上,都是3ml或者3.5ml或者2.6ml/孔?难道是培养基加多了?还有变的地方就是消化特别好的那次,中间拿出来勤一点,摇匀或者观察了几次,后面有经验了反而中间只在三天半换一次液,反而贴牢了?PS:M-CSF的我也能消化下来,而且为了能好消化,专门买了表面未处理的不易贴壁好消化的六孔板,快崩溃了,哪位战友深处灵魂一指拯救我一下。为了能好消化,我都把成功的protocol每一步当时就记下来了,后来照做,完全不行!崩溃