EMSA竞争性条带为何比样品反应更强？

主要操作步骤

1. 探针的标记：
  使用生工合成引物，在双链的5`端标记Biotin，后使用碧云天退火缓冲液退火形成双链。

2. EMSA胶的配制：8%非变性PAGE胶

3. EMSA结合反应：

（标记探针终浓度为5nM，未标记探针终浓度为1μM，使用的纯化转录因子蛋白，约5μg/μL）

a、阴性对照     Nuclease-Free Water                  7

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)       2

纯化的转录因子                   0

标记好的探针                     1

b、样品反应     Nuclease-Free Water                  6

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)       2

纯化的转录因子                   1

标记好的探针                     1

c、探针冷竞争   Nuclease-Free Water                  5

EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)       2

纯化的转录因子                   1

标记好的探针                     1

未标记探针                       1

加入探针前使反应体系室温放置10min，先加入竞争探针，室温放置20min，再加入Biotin标记探针，室温放置20min，加入1μL无色loading buffer，上样电泳。

4.电泳：

a.用0.5XTBE作为电泳液，100V，预电泳60min。

b.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内，100V电泳，将电泳槽置于冰浴中。电泳至蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/3处，停止电泳。

5.转膜：

a.取一带正电尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡15min。

b.按照三明治法将胶和膜夹在一起，中间无气泡，采用Western电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，冰浴，380mA转膜45min。

c.转膜完毕后，取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体，保持上表面湿润

7.交联：254nm紫外灯，10cm距离，照射10min。

8.检测：封闭液封闭30min，加入含Streptavidin-HRP Conjugate（1:2000）的封闭液，摇床孵育30min，洗涤液洗涤5min * 4次，平衡液平衡5min，ECL显色。

具体实验结果

问题：

相比样品反应，为何竞争反应条带更强，就算没有竞争，但是条带更深有点不明白。