求助原代脂肪干细胞的培养
1 取3~4周龄SD雄性大鼠,体重100~120g,处死后浸泡于75%的乙醇中51~0分钟。在无菌条件下剪开腹股沟处的皮肤,获取白色的皮下脂肪,放在有PBS的培养皿中,将脂肪组织剪成1m³m,用PBS冲洗三遍,
2 将冲洗干净的脂肪组织放在离心管中,加入3倍体积的0.075%Ⅰ型胶原酶,在恒温孵育箱内37℃下消化,期间每10min震荡一次。75min后取出加入同体积高糖DMEM培养基终止消化,用吸管反复吹打混匀。
3 1500转离心10min,弃去上清和残余的脂肪组织,加5mlDMEM(含10%FBS和1%双抗)重悬细胞沉淀,200目尼龙筛网过滤,滤液离心10 min;
4 去掉上清,加入2 mL10%FBS的DMEM重悬沉淀,再以200目尼龙筛网过滤,收集滤液,将细胞接种到25cm的培养瓶中,置于37℃ ,5%CO2孵箱内培养,48小时后观察到细胞仍是脂滴状,
有谁知道我哪里出错了吗?为什么细胞不生长?