多肽分析分离方法都有哪些

      多肽类化合物广泛存在于自然界中，其间对具有必定生物活性的多肽的研讨，一向是药物开发的一个首要方向。生物体内已知的活性多肽首要是从内排泄腺安排器官、排泄细胞和体液中发作或取得的，生命活动中的细胞分解、神经激素递质调理、肿瘤病变、免疫调理等均与活性多肽密切相关。跟着现代科技的飞速开展，从天然商品中取得肽类物质的手法也不断得到进步。一些新办法、新思路的运用。不断有新的肽类物质被发现运用于防病治病当中。这篇文章介绍了近几年肽类物质别离、剖析的首要办法研讨进展。 

      1 别离办法 采纳何种别离纯化办法要由所获取的安排资料、所要获取物质的性质决议。对蛋白质、多肽获取别离常用的办法包含：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉积法、离子交流层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些办法常常组合到一起对特定的物质进行别离纯化，一起上述这些办法也是蛋白、多肽类物质剖析中常用的手法，如层析、电泳等。

       1.1 高效液相色谱（HPLC） HPLC的出现为肽类物质的别离供给了有利的办法手法，因为蛋白质、多肽的HPLC运用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅能够在短时刻内完结别离意图，更首要的是HPLC能在制备规划上出产具有生物活性的多肽。因而在寻觅多肽类物质别离制备的最好条件上，不少专家做了很多的工作。怎么坚持多肽活性、怎么挑选固定相资料、洗脱液品种、怎么剖析测定都是现在研讨的内容。 

      1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC） 成果与保留值之间的联系：运用RP-HPLC别离多肽首先得断定不一样构造的多肽在柱上的保留状况。为了取得一系列的保留系数，Wilce等运用多线性回归办法对2106种肽的保留性质与构造进行剖析，得出了不一样氨基酸构成对保留系数影响的联系，其间极性氨基酸残基在2～20氨基酸构成的肽中，可削减在柱上的保留时刻；在10～60氨基酸构成的肽中，非极性氨基酸较多也可削减在柱上的保留时刻，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸添加可延长在柱上的保留时刻。一起有不少文献报导了肽链长度、氨基酸构成、温度等条件对保留状况的影响，并运用计算机处理剖析得到每种多肽的别离获取的最好条件。 肽图剖析（Peptide Mapping）：肽图剖析是依据蛋白质、多肽的分子量巨细以及氨基酸构成特色，运用专注性较强的蛋白水解酶[通常未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于格外的肽链位点将多肽裂解成小片断，经过必定的别离检查手法构成特征性指纹图谱，肽图剖析对多肽构造研讨合特性辨别具有首要意义。运用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，经过RP-HPLC法选用C18柱检查了重组人生长激素特征性胰肽图谱。一起胰岛素的肽图经V8酶专注裂解也制得，并可辨别仅相差一个氨基酸残疾的不一样种属来历的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体构造也运用酶解法及在线剖析技能断定了肽图，便于判定剖析。此项技能现已在新药开发中得到广泛运用。 

      1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC） HIC是运用多肽中富含疏水基因，可与固定相之间发作疏水作用而到达别离剖析的意图，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特色。运用GIC别离出产激素（GH）商品的构造与活性比EP-GPLC别离的要安稳，活性较安稳。Geng等运用HIC柱的低变性特色，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。经过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的商品。不一样人尿表皮生长因子（EGF）也运用HIC纯化到了，均具有杰出的生物活性。HIC可将未经离子交流柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能到达这一请求。

      1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC） SEC是运用多肽分子巨细、形状区别来别离纯化多肽物质，格外对一些较大的集合态的分子更为便利，如人重组生长激素（hgH）的别离，不一样构造、构型的GH在SEC柱上别离做法彻底不一样，然后可别离不一样构型或在氨基酸序列上有细小区别的变异体，运用SEC研讨润饰化的PEG的别离办法，此PEC具有半衰期长、作用强的特色。一些分子量较大的肽或蛋白均可运用此法别离剖析。

      1．1．4离子交流色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC） IEXC可在中性条件下，运用多肽的带电性不一样别离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新式树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交流纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的别离剖析研讨中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研讨较多，不一样的多肽别离条件有所不一样，格外是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报导运用离子交流柱层析法，讨论别离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的获取条件，取得了有价值的数据供往后此类物质别离研讨。

      1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP） CMP+别离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析体系，通常有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后构成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子别离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相联系首要决议于膜蛋白的巨细、SDS联系量有关。运用原子散射法研讨cAMP的别离机制发现，样品与SDS联系后在离子交流柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交流，然后到达分级别离的意图。

      1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC） HPDC是运用小分子高效置换剂来交流色谱柱上的样品，然后到达别离的意图。它具有别离组分含量较少成分的特性。运用HPDC判定别离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。在研讨非毒**流剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的杰出置换剂，通常DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研讨标明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相联系，因而在别离相对分子质量小的多肽时，需求更小的置换剂才干将其置换纯化出来。

      1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC） PC是一种依据分子筛原理与高速活动的活动相的层析别离办法，固定相孔径巨细及活动相速度直接影响别离作用。试验证明其在出产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。现在市场上可供给的PC固定相品种较多，适合于不一样分子量的多肽别离运用。 

      1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC） AC是运用衔接在固定相基质上的配基与能够和其特异性发作作用的配体之间的特异亲和性而别离物质的层析办法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻觅特异亲和作用物质上发现了很多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。对多肽类物质别离现在首要运用其单抗或生物模仿配基与其亲和，这些配基由天然的，也有依据其构造人工合成的。Patel等人运用一系列亲和柱别离纯化到了安排血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。 固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来开展起来的一种亲和办法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可经过配为键鳌合侧链富含Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，格外是肽序列中富含His-X-X-X-His的构造最易联系到金属离子亲和柱上，纯化作用较好。其间胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶交融蛋白等均用此办法别离到纯度较高的商品。 Chaiken等人报导了另一种亲和层析办法，运用反义DNA表达发作，其与正链DNA表达发作的肽或蛋白具有必定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法别离得到。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的办法。将人工合成的寡核苷酸联系在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之联系可到达别离特定构造多肽的意图。

      1.3 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--别离剖析办法 CE是在传统的电泳技能基础上于本世纪60年代末由Hjerten创造的，其运用小的毛细管替代传统的大电泳槽，使电泳效率进步了几十倍。此技能从80年代以来开展迅速，是生物化学剖析工作者与生化学家别离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE依据运用原理不一样可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和胶束电动毛细管层析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。

      1.3.1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE） CZE别离多肽类物质首要是依据不一样组分中的化合物所带电性决议，比传统凝胶电泳更精确。现在存在于CZE别离剖析多肽物质的首要疑问是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发作反响，影响峰形与电泳时刻，关于这些疑问不少专家做了很多试验进行改进，如调理电池泳液的PH值，使与硅醇反响的极性基团削减；改进毛细管柱资料的构成，关于多肽性质的不一样采纳不一样的CZE办法研讨别离5个含9个氨基酸残基的小肽，断定了小肽剖析的基本条件，即在低PH条件下，缓冲液中富含必定浓度的金属离子如Zn2+等，此刻别离速度快并且精确。

      1．3．2细管等电聚电泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF） 因为不一样的蛋白、多肽的等电点（PI）不一样，因而在具有不一样pH梯度的电泳槽中，其可在等电点pH条件下集合沉积下来，而与别的肽类别离开来。CIEF在别离、剖析混合多肽物质中运用不多，首要运用与不一样来历的多肽异构体之间的别离，如对rHG不一样异构体别离。因为在CIEF柱外表掩盖物的不安稳性限制了此法的广泛运用。 

      1．3. 3毛细管凝胶电泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE) CGE是依据分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中首要靠分子形状、分子量不一样而别离。现在，又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的别离剖析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽别离，这种凝胶易于灌注，运用寿命长，性质较为安稳。

      1．3．4胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC） MECC的原理是在电泳液中参加外表活性剂，如SDS，使一些中性分子带一样电荷分子得以别离。格外对一些小分子肽，阴离子、阳离子外表活性剂的运用都可使之构成带有必定电荷的胶束，然后得到极好的别离作用。有文献报导在电解液中参加环糊精等物质，可运用权含疏水构造组分的多肽挑选性与环糊精的环孔作用，然后运用疏水作用使多肽得到别离。

      1．4多肽蛋白质别离工程的体系运用 以上说到的别离多肽的技能在实践运用过程中多彼此联系，依据别离多肽性质的不一样，选用不一样的别离手法。格外是后基因组年代，关于蛋白质组深化的研讨，大家关于别离多肽及蛋白质的手法不断改进，综合运用了蛋白质和多肽的各种性质，选用包含前面说到的惯例蛋白多肽获取办法，一起运用了高效液相色谱，毛细管电泳，2-D电泳等手法别离得到细胞或安排中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研讨中体系运用蛋白和多肽别离判定的技能在此研讨中便是别离手法也是剖析办法之一。格外是以下说到的质谱技能的开展，大大的进步了蛋白多肽类物质的剖析判定的效率。

      2 剖析办法

      2．1 质谱剖析（Mass Spectrometry, MS） MS在蛋白、多肽剖析中现已得到了广泛运用，格外是在别离纯化后的在线剖析中，MS的高敏性、疾速性格外适合多肽物质剖析判定。其间连续流快原子炮击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和电雾离子化质谱（Electrospray Ionization, EIS）是近几年开展起来的新办法。 

      2．1．1连续流快原子炮击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB） cf-FAB是一种弱离子化技能，可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或（M-H）形式。首要运用于肽类的别离检查，其具有中等分辨率，精确度大于+0.2amu，流速通常在0.5-1.5μl·Ml-1。在测定使活动相需加0.5%-10%基质如甘油和高有机溶剂成分，使样品在检查探针处到达敏感染。cf-FAB常与HPLC、CEZ等办法联系运用达别离剖析的意图，很多多肽的cf-FAB剖析办法现已树立，并得到极好的运用。如Hideaki等运用此法研讨L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在坚持小肽构相安稳性。衔接分子方面具有首要意义。 

      2.1.2 电雾离子化质谱（Electrospray Ionozation，EIS） EIS可发作多价离子化的蛋白或多肽，答应相对分子质量达1×105蛋白进行剖析，分辨率在1500-2000amu。精确度在0.01%摆布。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线剖析，且需求气化或有机溶剂使样品敏感染。运用EIS与HPLC联合别离剖析GH和血红蛋白均获成功，其也可与CEZ联合运用。

      2.1.3 基质辅佐激光解析/离子化-飞翔时刻质谱（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS） MALDI-TOF是现在蛋白质判定中精确测定测定分子质量的手法，格外适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定，灵敏度和分辨率均较高。它是现在蛋白质组学研讨的必备工具。一起联系液相色谱的联用技能能够高效率的判定多肽物质。格外是当各种原理的质谱技能串联运用时，不光能够得到多肽的相对分子质量信息，还能够测定它的序列构造，此项技能将在未来蛋白质组学研讨中起到决议性作用。 

      2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR) NMR因图谱信号的纯数字化、过度的堆叠规模过宽（因为相对分子质量太大）核信号弱等因素，在蛋白、多肽物质的剖析中运用一向不多。跟着二维、三维以及四维NMR的运用，分子生物学、计算机处理技能的开展，使NMR逐步成为此类物质剖析的首要办法之一。NMR可用于断定氨基酸序列、定量混合物中的各组分构成含量等剖析中。但要运用于蛋白质剖析中仍有很多疑问需求处理，例如，怎么使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性剖析，怎么削减数据处理的时刻疑问等。这些疑问多有不少专家在进行研讨。虽然在蛋白质剖析中运用较少，NMR在剖析分子中含少于30个氨基酸的小肽时对错常有用的，能够战胜上述蛋白质剖析中的缺点而到达疾速精确剖析的意图。 

      2.3 别的 除上述办法以外，氨基酸构成剖析、氨基酸序列剖析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物判定法、放射性同位素标记法及免疫学办法等都已运用于多肽类物质的成果判定、剖析检查当中。 以上扼要的介绍了近几年多肽物质别离、剖析的常用办法及最新研讨方向。跟着科学技能水平的不断开展，会有很多更新的别离剖析手法不断涌现，因而这一范畴的研讨具有广阔的远景。

      运用SDS-PAGE显示小分子多肽SDS-PAGE在别离、判定和纯化蛋白质方面有着广泛运用，其有用别离规模取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度，其孔径跟着双丙烯酰胺与丙烯酰胺比率的添加而减小，比率接近于1：20时，孔径到达最小值。分子量低于10kD的小分子肽类，即运用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE也不能彻底别离，或是显不出色，或是显带较弱，带型弥散。且分子量越小，作用也越差。为了能在SDS-PAGE上显示测定小分子量的多肽，通常采纳两种办法：一是添加凝胶的浓度和交联度，在制胶时参加一些能够下降聚丙烯酰胺凝胶网限孔径的溶质分子，运用尿素、甘油或蔗糖等物质；二是挑选缓冲液中的拖尾离子的品种和浓度以到达改进多肽的别离作用。

      操作步骤1．电泳缓冲液的制造如下表所示缓冲液Tris(mol/L)Tricine(mol/L)pHSDS(%)阳极缓冲液阴极缓冲液胶缓冲液0.20.13.0—0.1—8.9*8.25**8.4*—0.10.3* 用HCl调pH** pH约为8.252．丙烯酰胺储存液的制造单丙-双丙混合物单丙的百分数双丙的百分数49.5% T, 3%C49.5% T, 6�846.51.53.0T：丙烯酰胺的总浓度C：交联度3．胶的制备，与通常SDS-PAGE类似，按下表制造别离胶和浓缩胶组 份别离胶16% T，6%C浓缩胶6% T，3%C49.5% T, 3%C丙烯酰胺溶液（ml）49.5% T, 6%C 丙烯酰胺溶液（ml）胶缓冲液（ml）脲（g）[甘油（ml）]水（ml）10%过硫酸铵（μl）TEMED（μl）总体积（ml）—3.33.33.6[2.4]1404.010.040.48—1.00—1.50252.53.034．样品缓冲液4% SDS12%甘油50mmol/L Tris 2%巯基乙醇0.01% Serva blue多肽样品与样品缓冲液混合沸煮2min（或40℃温浴30min）。

      5．将灌胶的玻璃板固定在电泳装置上，用1%琼脂糖封边，倒入阴极缓冲液，顺次加样。

      6．将电泳装置放入电泳槽内，倒入阳极缓冲液，将正负极与电泳仪相接，恒电压50~60V，待指示剂进入别离胶后，电压可升至70~90V，恒压约3h待指示剂走出凝胶下缘中止电泳。

      7．染色、脱色及胶的保留同SDS-PAGE。