Western blot结果常见问题分析

Western blot结果常见问题分析

蛋白免疫印迹 (western blot,即WB),想必做蛋白相关实验的小伙伴们都很熟悉,这里就不过多赘述了,但是做起实验并没那么容易。每当我们准备好样本,满怀希望自己可以做出这样的实验结果时:

结果却只能得到这样

还有这样,目的条带傻傻分不清

甚至是这样的

面对这些残忍的现实时,我们该怎么抉择?重复一次?换个蛋白?换个抗体?显然这些方案都不是更佳的方案。

为了避免出现以上问题,现在就给大家梳理一下western blot中常见问题以及对应的解决方案。

1、条带形状不好看怎么回事?

可能的原因有:

◐ 凝胶的不均匀或聚合不好,应对策略---灌胶前将溶液充分混匀。

◐ 样本盐浓度较高,应对策略---样本进行除盐或者将样本盐浓度调成一致。

◐ 缓冲液多次使用,导致成分发生变化,应对策略---重新配制。

◐ 凝胶下部有气泡,应对策略---电泳前先赶走气泡。

◐ 电泳时温度过高,应对策略---降低电流或电压。

2、没有条带是怎么回事?

可能的原因有:

◐ 二抗的HRP活性太强,将底物消耗光,应对策略---降低二抗的浓度。

◐ ECL底物中H2O2不稳定,失活,应对策略---更换ECL。

◐ ECL底物没有覆盖到相应的位置,应对策略---重新洗膜之后再次曝光。

◐ 一抗使用不当或者二抗失效,应对策略---在有效期内使用抗体,并对应来源。

3、背景高咋回事呢?

可能原因有:

◐ 洗膜不充分,应对策略---建议增加洗液体积和洗涤次数。

◐ 封闭不彻底,应对策略---提高封闭液的浓度,孵育时间,保证封闭液完全浸没转印膜。

◐ 封闭物使用不当,比如检测生物素标记的蛋白时不可以用脱脂奶粉,应对策略---针对不同的蛋白使用不同的封闭物。

◐ 抗体非特异性结合,应对策略---可以降低抗体的浓度或者减少孵育的时间。