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【求助】LA PCR 扩增6.7kb的目的基因

医疗行业从业者 · 最后编辑于 2005-05-10 · IP 江苏江苏
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这个帖子发布于 20 年零 43 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位老师,师兄师姐:
大家好!
我最近在扩增一段基因,由于片断较长,有6.7kb,跑了几次PCR均没有结果,我现在把我的反应体系和条件列出来,希望各位老师和师兄师姐能够帮帮我,找找原因。
反应体系:
10×LA PCR buffer  5ul
dNTP(2.5mMeach)  8ul
模板  500ng
引物1(20uM)  1ul
引物2 (20uM) 1ul
LA Taq 酶(5U/ul)  0.5ul
加水至  50ul
反应条件(1):
94℃  5min
【94℃  45s
57.2℃  1min
72℃  7min】30个循环
72℃  10min
12℃  保存
反应条件(2):
94℃  1min
【98℃  20s
60℃  6min】 14个循环
【98℃  20s
60℃  6min 】16个循环(每循环增加15s)
72℃  10min
12℃  保存
由于刚进实验室,而且我们是胚胎实验室以前没有涉及到分子领域的实验,以上反应体系和条件都是我自己设定的,用反应条件(1)和(2)均没有扩增出目的条带。我的模板DNA提的还可以,目的基因的GC含量为35%左右,用的是宝生物的LA Taq 酶,引物合成报告单上上下游引物的TM值非别为67.2℃和67.9℃,是不是我的退火温度也要这么高?请各位有经验老师和师兄、师姐给我找找原因,不胜感激!

























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