【求助】LA PCR 扩增6.7kb的目的基因
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大家好!
我最近在扩增一段基因,由于片断较长,有6.7kb,跑了几次PCR均没有结果,我现在把我的反应体系和条件列出来,希望各位老师和师兄师姐能够帮帮我,找找原因。
反应体系:
10×LA PCR buffer 5ul
dNTP(2.5mMeach) 8ul
模板 500ng
引物1(20uM) 1ul
引物2 (20uM) 1ul
LA Taq 酶(5U/ul) 0.5ul
加水至 50ul
反应条件(1):
94℃ 5min
【94℃ 45s
57.2℃ 1min
72℃ 7min】30个循环
72℃ 10min
12℃ 保存
反应条件(2):
94℃ 1min
【98℃ 20s
60℃ 6min】 14个循环
【98℃ 20s
60℃ 6min 】16个循环(每循环增加15s)
72℃ 10min
12℃ 保存
由于刚进实验室,而且我们是胚胎实验室以前没有涉及到分子领域的实验,以上反应体系和条件都是我自己设定的,用反应条件(1)和(2)均没有扩增出目的条带。我的模板DNA提的还可以,目的基因的GC含量为35%左右,用的是宝生物的LA Taq 酶,引物合成报告单上上下游引物的TM值非别为67.2℃和67.9℃,是不是我的退火温度也要这么高?请各位有经验老师和师兄、师姐给我找找原因,不胜感激!
最后编辑于 2005-05-10 · 浏览 1818