【原创】病理学之免疫组化染色篇

石蜡切片免疫组化实验步骤（二步法两天完成）
第一天：
1. 切片脱蜡：将切片依次放入二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，然后蒸馏水浸泡2min。
2. 抗原修复：我们采用微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的不锈钢（或耐高温塑料）切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）。到时间后将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。
3. 阻断内源性过氧化物酶：将配制好的3%的过氧化氢滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min（一般用甲醇或蒸馏水稀释30%过氧化氢），PBS冲洗3次，每次3min。
4. 加一抗：用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加PBS。加完一抗后于4°C湿盒中孵育过夜。
第二天：
5. 加试剂2(Polymer Helper)：PBS 冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加试剂2（聚合物辅助剂），室温或37℃孵育20min。
6. 加试剂3（polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG)：PBS 冲洗切片3次，每次2min，吸水纸擦干切片后滴加试剂3（辣根过氧化物酶标记二抗IgG多聚体），室温或37℃孵育20-30min。
7. 加显色剂：PBS冲洗切片4次，每次3min，甩去PBS液，吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间要控制好，切勿显色过深，当觉得可以时用自来水冲洗切片终止显色。
8. 复染：Harris苏木素复染，一般30s-1min左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用自来水（或PBS）水洗返蓝。
9. 脱水：将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片。
10. 封片：将中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的切片平躺置于通风橱中晾干。
11. 镜检拍照：晾干的切片可以在显微镜下观察或者采集图像。
指标：brdu

指标：Renin receptor

指标：IBA1

指标：CD34

指标：Dab1

指标：VEGF