【资源共享】流式细胞术检测应用
发布于 2015-08-08 · 浏览 2.0 万 · IP 江西江西
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dachong99 +9 丁当 下面附件可见清晰的图片
| 一、 |
| 简介 |
| 1.流式细胞术（FlowCytometry，FCM）： |
| 就是对在高速流动的鞘液包裹下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种 细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃 至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特 征的细胞分离出来，这就是分选技术。 |
| 2.工作原理： |
| 待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清 洁气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样 品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。 在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包裹下由流动室下面的 喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细 胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。在与入射激光和液柱都垂直的方向设 置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成 电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。 |
| 3.重要参数 |
| 前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一 个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细 胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧 向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。 荧光信号（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同 的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记 的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以 将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞 和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可 测出三个FL，即FL1、FL2、FL3。 |
| FL2-W指检测荧光的脉冲宽度，区分单个细胞和双联体细胞 |
| FL2-H指脉冲高度，细胞单位面积上的荧光浓度 FL2-A指脉冲面积，即细胞荧光总和 |
| 二、 |
| 细胞周期检测 |
| 1.原理： 细胞内的DNA含量随着细胞周期进程发生周期性变化。利用PI标记的方法， |
| 通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百 分比，反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量。其中PI即碘化 丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式 细胞术检测与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。 |
| 图1 |
| 表示细胞周期示意图，横坐标表示DNA含量，纵坐标表示细胞数，其中G0/G1 |
| 期细胞数为2N，S期为2N-4N，G2/M期为4N。 |
| 2.重要参数： |
| 变异系数（CoefficientofVariation，CV）：表示流式分析中DNA含量的分辨 |
| 率或精确度，通常由G0/G1峰的CV来反映 |
| DI（DNA指数,判断倍体数）=（标本G0/G1期细胞峰的平均荧光道数）/（正常 |
| 二倍体细胞G0/G1期细胞峰的平均荧光道数） |
| PI(增殖指数,表示细胞的增殖活性)（%）＝（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M） |
| ×100% |
| SPF(S期细胞比率,表示细胞的增殖活性)（%）=S/（G0/G1+S+G2/M）× |
| 100% |
| 3.结果分析： |
| 发现DNA异倍体(二倍体峰DI>1.1或<0.9；四倍体峰DI>2.1或<1.9)，诊断 为肿瘤或癌前病变； |
| 如无明显异倍体，但有一个突出的4倍体细胞峰和>15%的S期细胞，并伴有G0/G1 峰的CV增大，提示为肿瘤或增生旺盛的病变； 4.图片展示： |
| 图2.1 |
| 表示正常细胞的流式细胞周期图，同时还可以得知各个时期的细胞比例 |
| 图2.2 |
| 表示发生凋亡的细胞周期图，在G0/G1期之前出现的峰称为凋亡峰 DNA亚G1峰(凋亡峰)的检测：凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将 DNA降解， 分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞 内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。 |
| 图2.3 |
| 表示出现DNA异倍体，DI大于1.1，可能发生肿瘤或癌前病变 |
| 图2.4 |
| 表示细胞增殖旺盛，S期细胞大于15%，且CV值较大，推断为肿瘤或增生旺盛的 |
| 病变 |
| 结果展示： |
| 结果描述： |
| We further investigated the effect of miR-370 on proliferation using flow cytometry. MiR-370-overexpressing PC3 and DU145 cells had a significantly lower percentage of cells in the G1/G0 phase and increased percentage of cells in the S phase, compared to NC transfected cells. |
| 三、 |
| 细胞增殖检测 |
| 1.示踪染料标记法 |
| 原理：示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合，主要有两种结合方式：进入 胞内与蛋白质共价结合，如CFSE和BRSE；嵌入细胞膜的磷脂双分子层，与细 胞非公价结合，如PKH类和CellVue类等。 CFSE是活细胞染料，又称 CFDA-SE或 CFDA，其标记细胞后对细胞毒性小， 被激发后能发出很强荧光，且非常稳定，只有当细胞分裂时，母细胞内的染料会 被平均分配到子细胞中，细胞的荧光信号减少一半，细胞分裂代数越多，信号降 低程度越大。 |
| 图片展示： |
| 图 3 图中横坐标表示荧光信号，纵坐标表示细胞数，每一个峰代表一个代数，横坐标 从右往左信号逐渐降低，表示分裂代数增加，细胞增殖 文献中图表展示： |
| Histograms show CFSE intensity of viable cells compared with the autofluorescence of unlabeled cultured NK cells (line histogram). The number of cell cycles was determined from the geometric mean fluorescence intensity of control CFSE-labeled NK cells. M1 are undivided (quiescent) cells; M2 through M6 refer to cell cycles 1 through 5. |
| 结果描述：Quantitative analysis of the CFSE data in Fig. 2D shows that for control cultures, the 28,000 NK cells recovered originate from an estimated 27,664 progenitor cells, and that only 2.4% of these progenitor cells divide (27,328 remain in M1). By contrast, the 38,700 NK cells recovered in cultures stimulated by CD16 ligation originate from an estimated 12,813 progenitor cells, of which 52.6% divide (6,076 remain in M1). When cell yields at day 6 are compared with the estimate of progenitor cells in the 18 different experiments, there is on average a 2.1460.27 |
| (SEM)-fold increase in cell number in cultures stimulated by CD16 ligation, compared with 1.0760.02-fold in control cultures. 2. BrdU标记法 |
| 原理：5-溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖DNA合成时 可与内源性的胸腺嘧啶（T）竞争渗入正在复制的DNA分子，而BrdU抗体可 特异性识别BrdU，准确地反映细胞的增殖情况。 BrdU标记时同时加入 DNA染料（PI或 ADD），结果为一个典型的马蹄形 峰，不仅能得到G0/G1期、S期和 G2/M期的比例，还能比较不同细胞 DNA合 成能力的不同。 |
| 图4.1原理示意图 |
| 图片展示： |
| 图 4.2 |
| 图中既可看到细胞周期分布，也可看到细胞增殖状况。左边为散点图，横坐标表 示DNA含量，纵坐标表示BrdU荧光量，即细胞增殖情况，主要是 S期即 DNA |
| 合成期 |
| 文献中结果展示： |
| 图片描述：Each sample was halved and stained with an anti-BrdU antibody (a) or with an iso-type control antibody (b). The cells were gated to eliminate the debris and cell doublets. The debris was eliminated based on the physical attributes of the measured events by “Gate 1” on the FSC x SSC plot (event size x internal integrity/granularity). Cell doublets, characterised by wider fluorescence of the peak staining for DNA content and a higher size, were eliminated based on the DNA content (FL2 -A channel) and the width of the fluorescent peak (FL2-W channel) or the size of the event (FSC) by “Gate 2” on the FL2-W x FL2-A plot and by “Gate 3” on the FSC x FL2-A plot, respectively. Events that passed through a positive combination of gates 1-3 were further analysed in the FL2-A x FL1-H (BrdU staining) plot. The staining index was calculated as the proportion of the medians of BrdU-positive cells stained with the anti-BrdU antibody (a, S BrdU+ gate) to the G2/M-phase cells stained with an iso-type control antibody (b, G2/M gate). The percentage of BrdU labelled cells was calculated as the ratio of BrdU-positive S-phase cells (a, S BrdU+ gate) to all S-phase cells (a, sum of S BrdU+ and S BrdU- gates). 3.增殖蛋白检测 |
| Ki-67是一种与细胞增殖特异相关的核抗原，主要用于判断细胞增殖的活性。 Ki-67见于 G1晚期、S期、G2期和 M期细胞，G0期细胞无此抗原。 PCNA（proliferating cell nuclear antigen，增殖细胞抗原）是DNA聚合酶的辅助 蛋白，所以与DNA合成密切相关，是反映细胞增殖状态的良好指标。 |
| CD71是转铁蛋白受体，表达于细胞的表面，该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细 |
| 胞，在正常细胞中表达较少，与肿瘤细胞的增殖密切相关。 |
| 四、 |
| 细胞因子检测 |
| 1.简介： |
| 细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应等功能的蛋白或 |
| 小分子多肽。根据功能可分为六大类：白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿 瘤坏死因子、生长因子和趋化因子。胞内细胞因子：胞内染色法（ intracellular staining assay）；胞间细胞因子：CBA法（cytometric bead assay，流式微球阵列）。 其优点为单细胞水平，可多参数检测。 |
| 2.胞内细胞因子检测 |
| 原理： |
| 活化：自然状态下，静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少量细胞因子，刺激激活 后，细胞内的细胞因子合成增加。常用的刺激剂有佛波酯 PMA、离子霉素 （lnomycin）、ConA、PHA、LPS等。 |
| 抑制分泌：细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外。位于细胞内的细胞因子的 量很少，一般无法达到流式分析检测的最低标准，因此必须阻止细胞因子分泌到 细胞外。蛋白分泌抑制剂如莫能霉素（monensin）、BFA（brefeldin A）能抑制 细胞因子分泌，使其积累在细胞内。 |
| 图片展示： |
| Fig.1 Unstimulated lymphocytes secreting IL-17 in BALF 13. BALF (A) and PBMC (B) were stained for IL-17 or isotype control antibody and HLA-DR. Numbers in the upper quadrants represent the percentages of positive cells |
| in the lymphocyte FSC×SSC gate. |
| 3. CAB法 |
| CBA（cytometric bead assay，流式微球阵列）是新发展起来的能定量检测胞外游 离可溶性成分（如细胞因子等）的新方法。CBA应用领域包括血清、血浆、泪 液等体液标本以及细胞培养上清液中多种可溶性成分的检测。 原理：微球上包被细胞因子抗体后形成捕获微球（capture bead）能与样本中相应 的细胞因子特异性结合。这样捕获了细胞因子的微球就类似于一个细胞，加入相 应的荧光素检测抗体形成“三明治”式夹心复合物，上流式后就能得到细胞因子 的含量，如图4.1所示。 |
| 图4.1原理示意图 |
| 图 4.2 表示CBA微球是包被有荧光染料的，一系列荧光强度不同的微球就能同时检测 多种细胞因子 |
| 图 4.3 |
| CBAkit中含有已知浓度的标准品，测定前将标准品稀释成不同浓度，制作标准 |
| 曲线。 |
| 文献中结果展示： |
| 图4.4 Beads were selected in APC/APC-Cy7 dot plot and gated to allow for the quantification of the PE fluorescence intensity. A standard curve was constructed with human recombinant sCD23 to quantify the sCD23 content of each sample. |
| 图 4.5 |
最后编辑于 2015-08-09 · 浏览 2.0 万
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