凋亡细胞诱导免疫耐受的机制及意义
发布于 2002-09-25 · 浏览 8674 · IP 湖北湖北
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这篇文章是即将出版的《移植学前沿》中的一部分内容，放在这里，大家先看看，可能对大家科研选题有一定的帮助！
本人认为，这篇文章的思路还是很不错的。
凋亡细胞诱导免疫耐受的机制及意义
摘要：细胞凋亡的发现是生物和医学研究领域的里程碑，大量的研究证明细胞凋亡在生命过程中具有重要意义。免疫耐受是指机体对自身或外来抗原不产生损害性免疫反应，它也是免疫学和移植学的难题，诱导器官移植免疫耐受是近50年来移植学家的梦想。本文通过对近年来细胞凋亡和免疫耐受这两个方面的研究分析，认为：①凋亡细胞不仅仅是死亡细胞，同时在其死亡和被清除的过程中对免疫具有抑制性调节作用；②肝脏是体内清除凋亡细胞和诱导免疫耐受的场所；③吞噬细胞的状态对凋亡细胞的免疫调节作用有至关重要的影响；④凋亡细胞调节免疫可能是通过其本身或吞噬细胞分泌抑制性淋巴因子；⑤凋亡细胞诱导免疫耐受有重要的生理、病理和治疗意义，给移植免疫耐受的诱导、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的治疗带来新的希望。
细胞凋亡是生物界一种普遍现象，研究证明：①细胞凋亡既是一正常生理过程，参与生物体的各个阶段，包括生长、发育、衰老等，同时它也在很多疾病发生机制中起重要作用(1)；②细胞凋亡是一主动、程序化与耗能过程，是机体对衰老、病变或过时细胞的主动清除，它涉及到一系列“自杀性”酶的序贯活化和参与，最终由吞噬细胞将其吞噬并毫无痕迹地清除；③凋亡细胞形态学上最显著特征是磷脂酰丝氨酸（phosphtidylserine, PS）外翻、细胞膜皱缩以及核固缩、断片化等；④凋亡细胞碎片不直接释放到周围组织间隙，而是形成带有完整胞膜的凋亡小体，并且很快被吞噬和消化以免其内容物被释放到周围环境而造成损害；⑤细胞凋亡后由健康细胞补充，无需启动以纤维增生和瘢痕形成为主的修复反应。相反，细胞坏死是生命过程的偶然事件，一般发生在组织器官血供突然中断（栓塞）、感染或外伤等情况下。坏死是一非程序化被动过程，表现为细胞能量代谢突然终止、细胞肿胀、胞膜破裂、内容物释放到周围环境，其结果往往导致局部炎症反应，进而激活特异性免疫反应，并可能导致自身免疫性疾病(2)。坏死细胞缺损区域往往由体内修复系统修复，但是这种修复的性质是“抢救性”的，主要表现为成纤维细胞增生和纤维瘢痕形成，目的是尽快填补坏死区域，以保护周围健存的组织细胞。细胞凋亡的生理性、主动性和程序性提示了对其过程的可控性，因而燃起人们一种希望，即通过系统揭示细胞凋亡分子机制，找到一些干预措施控制细胞凋亡或拯救凋亡细胞，达到治疗疾病目的，这已成为近几年细胞凋亡研究领域主要方向。
有关细胞凋亡研究应该还存在另一个重要方向，即凋亡细胞是如何被识别、吞噬及清除的，以及此过程对其他细胞、组织和系统有何影响？这方面研究虽有一些报道但其广度和深度还远不及细胞凋亡分子机制研究 。但这一研究方向可能更为重要、更有意义。如前所述，人们普遍注意到凋亡细胞早期表现主要是两个方面：其一是胞膜皱缩、PS外翻等细胞膜变化；其二是核固缩、DNA断片化等细胞核变化。第一方面变化的意义显而易见：细胞膜皱缩与PS外翻可将凋亡细胞与健康细胞分离并表达“清除（eat me）”信号，意义是告之周围吞噬细胞：“本细胞已经死亡请尽快吞噬予以清除”(3)。为何凋亡细胞需要及时清除呢？这是由于凋亡细胞已丧失主动获取能量并完成代谢过程的能力，剩余能量供应有限，不能长时间维持主动耗能过程，若不及时清除则细胞膜破裂、内容物释放而导致周围组织与细胞的炎症与损害。然而，第二个方面变化似乎有些难以理解，即凋亡细胞被吞噬之前为何要启动一个主动耗能过程来将核染色质消化、DNA 断片化呢？我们知道，为了保证凋亡时能将核染色质充分降解，每一个组织细胞都需装备一套酶系统，而且这一系统中的各个要素在活细胞中既要维持一定张力又要保持非活化状态，细胞凋亡时还要再耗费一定能量激活该系统以实现对核质消化。现已查明，细胞确已装备了这样的酶系统（如CASPASES酶系），并在凋亡时激活，同时这一酶系在进化上相当保守 (在线虫、果蝇和哺乳动物的细胞均存在)，表明它是生命活动中一个基本和重要组成部分。然而，一旦细胞“被判死亡”，其胞内物质清除方式对凋亡细胞本身并不重要，而巨噬细胞是专业性吞噬细胞，胞内含有丰富降解酶系，通过巨噬细胞吞噬凋亡细胞并将细胞内容物降解比较合理。那么如何解释细胞装备一套如此复杂的“自我降解与消化酶系”以备“凋亡时不时之需”呢？这并非为了凋亡细胞本身，而是为了其周围健康细胞。细胞凋亡后到其被吞噬细胞吞噬之间存在一定的时间延迟，在此期间被细胞膜包裹的细胞核及一些细胞器，如果不加控制地释放到细胞外环境，会对组织细胞产生严重损害。这些损害主要有两个方面：其一是这些碎片通过对周围内环境的改变而直接损伤。其二是诱发自身免疫性疾病，凋亡细胞若未及时被吞噬细胞清除（这种情况在生理状态下一般不存在，但在某些病理情况下如SLE、病毒感染等时可能存在），除了引起局部炎症反应外，由于吞噬细胞（主要是巨噬细胞和树突状细胞，dendritic cell, DC）均为抗原提呈细胞，凋亡细胞被吞噬后其胞内和核内存在的抗原物质有可能被提呈，从而激活相应T细胞而引起自身免疫性疾病。因此机体及时清除凋亡细胞除了腾出空间以补充新的、健康的和有功能的细胞以及将凋亡细胞生物原料再利用等外，同时也是要防止自身抗原被“不适合地提呈”发生诱导自身免疫性疾病。
当一种抗原被抗原递呈细胞表面的MHC-抗原肽复合物提呈时与T细胞表面的TCR形成的第一信号途径，免疫系统对此抗原的反应主要有三种：免疫活化、免疫忽视、免疫抑制。凋亡细胞直接活化免疫细胞可能性很小，因为身体内每天均有大量凋亡细胞（如胃肠道粘膜上皮细胞的脱落、胸腺T细胞凋亡、白细胞凋亡等），但自身免疫性疾病很少。然而，若凋亡细胞因未被及时清除而坏死(4)，则有可能活化免疫细胞而发生自身免疫性疾病，如SLE等（见后述）。仅仅免疫忽视对机体并非万全之策，因为感染或外伤时会有大量活化抗原提呈细胞和淋巴细胞，若此时体内仍存在大量凋亡细胞，活化免疫相关细胞和淋巴因子可能通过旁刺激作用激活针对凋亡细胞抗原的T细胞克隆，使其增殖而导致自身免疫性疾病。笔者认为，凋亡细胞在其清除过程中防止产生自身免疫性疾病的万全之策是局部免疫抑制，使相应T细胞克隆灭能或删除，以产生对凋亡细胞抗原免疫耐受，在此情况下即使存在其它活化抗原提呈细胞或T细胞的因素也难以产生自身免疫性疾病（见图1）。
许多事实证明凋亡细胞的确具有免疫调节作用以抑制局部免疫反应，从经典的临床输血实践到自身免疫性疾病的发病机制研究，以及移植免疫耐受的进展等都有相应报道，本实课题组的研究还表明，凋亡细胞不但能抑制Ｔ细胞活化，而且其调节免疫特性在进化上保守，凋亡细胞能够诱导移植免疫耐受(5)。因此研究凋亡细胞被吞噬的机制以及其对免疫系统的影响不但有助于我们认识自身免疫耐受与自身免疫性疾病的发病机制，而且对临床上寻找相应治疗策略和诱导移植免疫耐受有重要意义。
一、 临床输血给我们的启示
输血已有数十年历史，在医学实践尤其是外科领域中扮演重要角色。虽然输血主要目的是补充血液成分尤其是红细胞，以提高机体携氧能力，但令人不解的是,为何输血能导致免疫抑制呢?
早期临床观察发现输血可以增加外伤及手术后感染，输血量与感染发生率呈正相关，若输血少于3～4单位，则感染发生率显著降低，输血也可减少手术后自身免疫性疾病复发。移植界对输血的认识过程是曲折的，早期人们担心输血可能会使受者免疫细胞对供者抗原产生致敏、移植物出现加速排斥而不敢输血。1973年Opelz发现输血不但不会诱发加速排斥反应，相反可以延长移植物存活时间，到20世纪70年代末现输血优越性得到公认，此期间至环孢素A问世前移植医生普遍认为移植术前给受者输3～4单位全血对术后移植物存活有益，因而一时术前输血成为不少移植中心的常规(6, 7)。但环孢素A应用后输血效果显著降低，人们不清楚是环孢素A的显著免疫抑制作用相对抵消了输血效果呢？还是环孢素A能够直接抑制输血的作用 ？除了上述临床观察提示输血可能导致免疫抑制外，免疫学监测进一步肯定了输血的免疫抑制作用，如输血后受者NK、T细胞的增殖能力降低，而T抑制细胞的活性增加等。那么输血导致免疫抑制的原因是什么呢？由于临床输血中大部分是异体血，因此有人提出输血的免疫抑制作用也许来源于血液的异体性质，这一观点已被否定。因为对照自体输血和异体输血的结果发现，两者均有相似的免疫抑制作用，输自体血和异体血的感染发生率并没有差异(8)。人们进一步探讨了输血成分对免疫的影响，发现输全血或血浆均有免疫抑制作用，而输红细胞或去除白细胞的血液制品则免疫抑制作用较弱，表明免疫抑制作用来源于血液中的白细胞或血小板。为何白细胞及血小板在体内没有免疫抑制作用，而一旦离体保存后却具有免疫抑制作用呢？一个合理的猜测是血液离体后，白细胞和血小板的生存环境改变，使其发生凋亡，而正是这些凋亡细胞产生了免疫抑制。储存红细胞和血小板中确实存在粒细胞和淋巴细胞凋亡，因而间接支持了上述观点(9-11)。
二、 肝脏免疫特殊现象与凋亡细胞的关系
肝脏是人体最大消化和代谢器官，每日吸收营养物质，通过肝脏分解、加工和合成后转运到全身组织，同时全身一些代谢产物和毒性物质也在肝脏解毒，另外肝脏还产生胆汁以帮助消化吸收脂肪。然而大量事实证明肝脏在免疫方面有着明显独特性，而且这种特性中至少部分与凋亡细胞有关(12)。众所周知，肝脏易于诱导免疫耐受，若通过门静注射供者白细胞，可诱导皮肤、肝脏、胰腺、小肠等移植物耐受，甚至在异种移植也有通过门静脉注射诱导免疫耐受的报道(13-17)。若将移植物静脉与门静脉吻合可诱导移植物耐受，相反将移植物静脉与腔静脉吻合则免疫耐受丧失(18-20)。口服免疫耐受是免疫学的一个重要现象，然而作门腔分流后口服免疫耐受丧失(21)。在一些同种异基因肝移植动物模型（小鼠、部分大鼠和猪）中，受者可不用任何免疫抑制剂而移植物长期存活(22)。肝脏移植可逆转其它移植物排斥反应(23)。临床工作中发现，肝移植时HLA配型对移植物存活的影响没有肾移植和心脏移植那么显著，肝脏若与其它器官一起移植则可降低其它器官排斥发生率，部分肝脏移植病人也可完全停用免疫抑制剂而长期存活(24，25)。
脂多糖（LPS）是细菌内毒素的重要组成部分，是细菌刺激机体产生炎症和免疫反应的重要分子，免疫学上多被用作免疫反应辅助刺激因子(26)。已证明LPS（及其它炎性因子，如TNF-α、CD40L等）可诱导DC成熟产生共刺激信号，进而激活特异性免疫应答反应以清除细菌(27，28)。但是LPS对肝脏作用令人奇怪。因为在生理状态下发现门静脉内存在LPS（浓度达到10pg/ml）(29，30)，而这些LPS并未对肝脏产生炎性刺激反应或诱导局部免疫应答反应，尽管在门静脉内含有。相反，门静脉内LPS既刺激Kupffer细胞产生IL-10，又下调LSEC抗原提呈作用(30;31)。而LPS与LSEC体外培养，同样下调肝血窦内皮细胞（liver sinus endothelial cell, LSEC）的抗原提呈功能，减少LSEC表达MHC II、CD80和CD86(32)。虽然LPS也可刺激Kupffer细胞产生TNF-α，但如此产生的TNF-α对LSEC抗原提呈作用不是上调，而是下调(33，34)。
肝脏作为代谢器官，每日处理大量外来抗原、代谢产物以及毒物。肝脏除了接受胃肠道和动脉系统血液外，还接受脾静脉血液。其中脾静脉血液极有可能含有大量活化或凋亡淋巴细胞（见图2）。因此，肝内需要强有力调节机制以防止免疫反应“过度”导致肝脏和机体损伤或引起自身免疫性疾病。肝脏具有如此免疫特殊性的机制是什么呢？早期人们曾认为肝脏抗原性较弱，不能引起强烈免疫反应，因而称肝脏为免疫特惠器官（immune privileged）。然而分离纯化的肝细胞有相当数量MHC I类抗原表达，体外实验表明肝细胞可以刺激脾细胞产生CTL，用海绵作为基质行肝细胞体内移植实验发现肝细胞同样能刺激动物免疫系统产生CTL(35，38)。另一观点认为，肝细胞虽然可表达MHC I，但肝细胞与血窦之间有LSEC和Kupffer细胞阻隔，使其难以接触到淋巴细胞（图3）。但是LSEC和Kupffer细胞本身不但表达MHC I，而且可表达MHC II。无论从抗原提呈的能力和细胞数量（LSEC占肝脏细胞的30%，而Kupffer细胞占全身吞噬细胞80% ），如果没有受到其它某种因素控制，这两种细胞本身即足以诱发排斥反应(36)。另一方面，肝脏虽然易于诱导免疫耐受，但同时也具有强大免疫应答进行抗感染的能力。进入血液中大部分细菌均在肝脏内被杀灭，病毒性肝炎时产生的CTL可杀伤病毒感染肝细胞，分离培养的肝脏T细胞具有CTL杀伤和产生淋巴因子能力，这些都表明肝脏并非免疫特惠器官而是一特殊免疫器官(39-41)。
既然肝脏并非免疫特惠器官，那么何种原因使得肝脏在免疫方面具有如此特性而易于诱导免疫耐受呢？数十年来，Starzl提出的“微嵌合体”学说占据了移植界统治地位。该学说是指移植后肝脏中白细胞游走至受者全身组织器官中，这些细胞在受者体内形成微嵌合体，而这些微嵌合体诱导了受者对供者免疫耐受。主要依据是：①移植后耐受的部分临床受者的全身组织器官中发现了供者来源细胞（即“微嵌合体”）；②肝脏中发现一类特殊类型DC，其共刺激信号较弱，可能易于诱导免疫耐受(42-45)。但这一学说也有很多疑点：①理论上，受者体内淋巴细胞仅在淋巴组织和器官中循环（如淋巴结、脾脏等），供者抗原提呈细胞要诱导免疫耐受首先必须有机会接触到受者淋巴细胞，同时要保持其未活化状态，要做到这一点最好的办法就是驻留受者的淋巴器官；②生理情况下，未活化的抗原提呈细胞一般驻留在周围组织，活化后迁徙到附近淋巴组织。肝移植后如何呢？迄今证据表明，“微嵌合体”并非特异性地驻留受者淋巴组织，而是随机分布到全身组织器官。由于淋巴细胞一般不会浸润到周围组织（除非在炎症或排斥情况下），因此“微嵌合体”细胞接触到受者淋巴细胞的机会“微乎其微”； ③从肝脏中游走的抗原提呈细胞相对于受者全身淋巴系统其数量极少（受者体内要用PCR方法才能检测到），也没有证据表明这些细胞在受者体内会分裂、增殖。设想如此微量抗原提呈细胞又如何能诱导受者强大免疫系统免疫耐受呢？④如果供者细胞能够起一定的作用，那么肝移植时移植物本身也可视为一个“巨嵌合体”，移植肝内供者抗原似乎更有机会接触到受者淋巴细胞（因为有丰富的血供和淋巴回流），因而也更有可能诱导免疫耐受。而肝脏内细胞能够接触到童贞（naive）T细胞则提供了肝脏诱导免疫耐受的可能性 。因此，肝脏移植后发现体内存在“微嵌合体”细胞这一现象，可能并非肝移植免疫耐受的原因，而是免疫耐受的结果或伴随现象，将它视作免疫耐受的检测指标有一定意义(46)。
显然上述种种假说难以令人信服地解释肝脏免疫特殊现象，迄今为止仍难以对肝脏免疫特殊性作出肯定性结论。新近证据表明肝脏是凋亡细胞处理场所，肝脏“微环境”对其免疫调节作用至关重要，其中Kupffer细胞或LSEC对凋亡细胞吞噬及其对局部免疫的调节作用可能有助于理解肝脏免疫特殊作用。下面将进一步从肝脏作为凋亡细胞清除场所这一新视角重新审视肝脏免疫特殊性（见后述）。
三、 自身免疫性疾病与凋亡细胞吞噬
自身免疫性疾病是威胁人类健康的一大类疾病，对其发病机制讨论很多，但仍未有肯定性结论。这是一类病因复杂的多基因疾病，其中除了遗传性因素以外，环境因素也有重要影响。对于自身免疫性疾病研究无外乎要解决两个方面的问题：其一是自身抗原来源，其二是免疫系统激活机制。过去几年发现：凋亡细胞是自身抗原重要来源，如引起系统性红斑狼疮（SLE）的自身抗原即来自凋亡细胞皱折(47)。若凋亡细胞未及时被吞噬和清除，则有可能激活免疫系统产生自身免疫性疾病(48，49)。
理论上，自身抗原可来源于细胞膜分子、可溶性分子或胞内结构性分子，但是健康细胞由于不表达“清除”信号因而不被吞噬细胞所吞噬，因而其抗原不易被提呈。而体内每日有大量凋亡细胞被吞噬，这些凋亡细胞上装配的分子很容易被吞噬细胞上MHC所提呈，因而凋亡细胞作为自身抗原有足够细胞和分子学基础(50，51)。自身免疫性疾病患者可产生针对细胞内抗原的抗体（如SLE等），这提示自身抗原来源于细胞本身(50，52)。用凋亡胸腺细胞免疫动物可产生自身抗体，则进一步证实了自身抗原来源于凋亡细胞的假设(50，53，54)。巨噬细胞或DC吞噬凋亡细胞后，细胞降解后所产生的短肽可装配到MHC分子槽中，而且由于不同蛋白酶活化，使得被T细胞忽视的一些隐蔽抗原得以提呈(47，55，56)。
所有自身免疫性疾病中系统性红斑性狼疮（SLE）研究最多。SLE累及全身多个系统，同时其临床和实验室检查表现也多种多样。其抗原来源也不局限于细胞内某一个成分，而是涉及到细胞多种成分，如细胞核、细胞浆和细胞膜。凋亡细胞或凋亡小体内存在SLE患者自身抗原，其中包括来源于细胞核和细胞浆的自身抗原(55，57)。正常生物体内每天均有一定数量凋亡细胞，凋亡细胞降解后的“自身分子”每天都有可能被装配到抗原提呈细胞的MHC分子槽中，但是为何没有发生自身免疫性疾病呢(58)？这表明凋亡细胞来源自身分子要成为“自身抗原”一定还存在其它的某种因素将“自身分子活化为自身抗原”（见后述）。一种解释是自身免疫性疾病患者清除凋亡细胞能力降低或缺乏，从而诱发自身免疫性疾病(59)。这已得到一些证明：①SLE患者巨噬细胞吞噬能力下降。C反应蛋白可与补体C1q结合并促进凋亡细胞清除，而SLE患者体内这两种分子均降低(60)；②目前已知补体尤其是C1q参与了凋亡细胞清除，C1q可特异性地与凋亡细胞表面皱折结合(61，62)，C1q缺乏不但可引起人SLE，而且可导致小鼠出现SLE样免疫变化。C1q缺乏小鼠肾小球凋亡细胞增加，且出现肾小球肾炎样改变(63-65)。C1q缺乏病人单核-巨噬细胞对凋亡细胞吞噬能力降低，而补充C1q则可纠正(66)。除了C1q外，**也有可能参加了凋亡细胞清除，因为**缺失小鼠同样存在对凋亡细胞吞噬功能的损害(66)； ③许多SLE动物模型巨噬细胞对凋亡细胞的反应与非自身免疫性疾病动物模型相比存在明显异常(67)。
另外一个研究较多的自身免疫性疾病是糖尿病，在其发病过程种胰岛β细胞炎症反应是一重要病理过程。那么导致这种炎症反应的原因是什么呢？BB鼠和NOD鼠分别是糖尿病自身免疫性大鼠模型和小鼠模型，检测这两种模型均发现胰岛β细胞凋亡增加，同时在这两种模型中也发现巨噬细胞存在明显异常：要么数量减少、要么在识别和吞噬凋亡细胞方面存在功能缺陷(68-70)。有趣的是对于化学方法制备的小鼠糖尿病模型，用抗CD40L抗体易于诱导对胰岛移植物免疫耐受 ，而同样处理方法难以逆转NOD小鼠糖尿病(71)，也提示凋亡细胞清除能力降低可诱发自身免疫性疾病。
四、 凋亡细胞对T细胞抑制作用
以上证据及分析提示凋亡细胞可能对T细胞功能存在抑制性调节作用，并且在进化上应该具有保守性。有没有直接证据支持凋亡细胞对免疫的调节作用? Ponner等发现与活细胞相比，凋亡细胞免疫原性明显减弱(72)。Matzinger等在实验中发现，虽然坏死细胞可以活化DC，但凋亡细胞很难活化DC，甚至对LPS都没有反应(73)（Matzinger,通信交流）。笔者实验室结果首次证实凋亡细胞对T细胞活化有直接抑制作用。我们将培养的人K562细胞在体外与FTY720共温育，发现凋亡率为90%，将此凋亡细胞加入到ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系中，然后以CD69（T细胞早期活化指标）监测T细胞活化情况。发现在加入FTY720诱导凋亡K562细胞后，再用ConA刺激后CD69表达明显降低，表明FTY720诱导的凋亡细胞可以抑制ConA刺激后小鼠脾细胞活化。进一步研究发现，凋亡细胞免疫抑制作用并非FTY720或K562细胞株的特殊作用，因为我们用另外一种凋亡诱导剂（CHX）和另外一个细胞株（HL-60）进行实验取得了类似结果。这些结果表明，凋亡细胞的确对T细胞活化存在抑制作用(5)。由于K562和HL-60均系人细胞株，而我们加入的凋亡细胞是小鼠脾细胞，此结果还提示凋亡细胞对免疫的调节进化上保守性（图4）。我们同时还发现在体外混合淋巴细胞培养体系中，加入凋亡细胞可以抑制T细胞增殖(孙尔维等，未发表资料)。我们实验室进一步研究发现供者凋亡细胞还延长同种异基因移植物存活，甚至能诱导肝脏移植物长期存活（陈建峰，汪爽等，待发表）。提示应用凋亡细胞输注方法可能是诱导移植物免疫耐受的重要策略和方法，值得进一步加以研究。
五、 凋亡细胞调节免疫的其它证据
除前述证据外，其它研究也提示凋亡细胞与免疫抑制或免疫耐受有关。如紫外线照射可导致免疫抑制，该方法可治疗某些自身免疫性疾病，这与紫外线诱导了细胞凋亡有关。口服免疫耐受是免疫学的一个重要研究方向，有趣的是最近发现小肠上皮内有一类专职的DC（CD4- OX41- DC），专门从事将凋亡肠上皮细胞转运到引流肠系膜淋巴结的职能，并诱导T细胞对该DC提呈抗原的免疫耐受(74，75)。若将巨噬细胞与坏死肿瘤细胞共培养可大大增强巨噬细胞清除肿瘤作用，若与凋亡细胞共培养则不但不能清除肿瘤反而能促进肿瘤生长。FTY720是一个新型免疫抑制剂，其主要作用为诱导淋巴细胞凋亡。我们研究表明，给予FTY720可诱导大鼠同种异基因心脏移植物长期存活，提示细胞凋亡有可能用于免疫耐受的诱导。在眼前房（一个公认免疫特惠部位），如果单纯胞疹病毒感染后伴随有细胞凋亡，则可诱导局部免疫耐受；相反若被感染动物细胞不能启动凋亡程序（Fas或FasL缺失）则不能建立免疫耐受，表明细胞凋亡在眼前房免疫中起至关重要作用(76，77)。锥型虫（Trypanosoma Cruzi）病易于引起人持续感染，常合并心脏病理变化，主要感染细胞为巨噬细胞、心肌细胞等。该病在免疫学上显著特征是感染的同时伴有T细胞大量凋亡，而这种凋亡又促进了该寄生虫感染(78，79)。以上证据充分表明，凋亡细胞存在某种机制调节免疫、诱导免疫耐受。
六、 凋亡细胞调节免疫作用机制
综上所述，凋亡细胞具有局部诱导免疫抑制和免疫耐受作用。在生物体内凋亡细胞在何处调节免疫、那些细胞参与、何种分子介导和信号如何传递呢？弄清这些问题不但使我们能更清晰地理解凋亡细胞调节免疫作用机制，而且对免疫识别模型理解均有重要意义。
（一） 肝脏是特异性处理凋亡细胞的场所
肝脏是清除衰老红细胞主要场所，正常人每天大约有2.0×1012红细胞（约6.25克血红蛋白）需要清除，肝脏在清除红细胞同时还将其血红蛋白分解成氨基酸进行在利用。静脉注射氧化红细胞主要聚集在肝脏，注射后30分钟即有约30%被肝脏拦截(80)。中性粒细胞是机体抗感染的第一线细胞，具有数量大、反应灵敏特点，但在一些病理情况下，中性粒细胞也可对正常组织产生损害。中性粒细胞在体内代谢更新很快，血液中半衰期仅6小时，每天约有1.4×1010中性粒细胞凋亡，从而需要及时清除以维持机体抗感染状态稳定，而肝脏正是清除凋亡中性粒细胞的主要场所(81)。
肝脏作为体内清除衰老、死亡细胞场所有其独特点优势和意义。其一是肝脏血流量大（占循环血量25%）、肝内血流缓慢（肝窦内血流速度仅为一般毛细血管后小静脉的七分之一），由于血窦与肝板形成特殊结构，血液通过血窦时与肝脏内细胞接触面积大，血液中需要清除细胞很容易被肝脏拦截。肝脏是体内三大物质代谢场所，有丰富能量和酶系，细胞降解后物质容易被再利用。由于肝脏内同样有丰富淋巴循环（肝脏产生淋巴液约占胸导管20％～50%），有理由推断凋亡淋巴细胞也应在肝内被清除。新近证据表明肝脏确实是凋亡淋巴细胞积聚场所。给TCR转基因小鼠注射抗原，可在周围特异性地删除相应CD8+ T细胞克隆，而这些T细胞均聚集在肝脏并发生凋亡(82-84)。B220+是细胞即将凋亡的一个标志(85)，自发性糖尿病大鼠（BB鼠）B220+细胞聚集在肝脏，而周围CD8+ T细胞减少。虽然流感病毒侵犯部位主要局限在呼吸道，机体在与病毒对抗中产生的凋亡细胞不能在肺内被清除，而在肝脏内发现了大量凋亡CD8+T细胞(86，87)。 虽然肺泡内有相当数量的巨噬细胞，但它们并不能吞噬凋亡细胞。然而呼吸道面临大量感染性和非感染性颗粒的侵犯，巨噬细胞必定要对它们进行吞噬和处理，这提示对凋亡细胞的吞噬和对其它感染性及非感染性颗粒吞噬的细胞类型或机制不同(87)。通过肝脏灌流发现，肝脏还可特异性地拦截活化T细胞，并且在肝内诱导这些T细胞凋亡(84，88)。
（二） 巨噬细胞是吞噬凋亡细胞的主要细胞
何种细胞能够吞噬凋亡细胞，何种分子介导了吞噬作用呢？目前越来越多证据表明巨噬细胞是吞噬凋亡细胞的主要细胞。1985年Duvall等发现，将腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞共温育，巨噬细胞可与凋亡细胞特异性结合，证明巨噬细胞能特异性地吞噬凋亡细胞，并认为巨噬细胞这种特异性识别是通过其细胞表面凝集素样分子介导的。目前研究提示，在巨噬细胞表面有几种受体介导了凋亡细胞吞噬，如SR-A，CD36，CD14，ABC-1，PStR，MER，ICAM-3等，但究竟是何种受体起主要作用，还是数个受体协同作用仍不清楚（表1）(89-95)。除了吞噬细胞表面受体外，补体也是介导吞噬的一类重要分子，吞噬细胞上有补体受体而细胞凋亡时PS外翻能激活补体系统，补体缺乏不但损害吞噬细胞吞噬功能，而且可能是自身免疫性疾病的一个发病机制(96)。而这些吞噬受体在线虫、果蝇和人类均有发现，提示这些分子进化的保守性。Kupffer细胞是肝脏主要吞噬细胞，门静脉灌流活化淋巴细胞，10分钟后约有60%淋巴细胞与Kupffer细胞结合，90分钟以后则全部与Kupffer细胞结合(88)。氯化钆（GdCl3）是Kupffer细胞吞噬阻断剂，若给予氯化钆阻断Kupffer细胞的吞噬作用，则门静脉注射供者抗原诱导免疫耐受能力丧失(97-99)，进一步证明了肝脏Kupffer清除凋亡细胞的作用。也有证据表明DC能够吞噬凋亡细胞，但其对免疫反应的调节是诱导免疫耐受还是应答反应仍有争议。一些报道认为吞噬凋亡细胞的DC能够诱导免疫耐受，另一些则报道可诱导免疫应答反应(75，54，100，101， 31)。
为何DC对凋亡细胞吞噬和抗原提呈表现出如此的复杂性呢？Steinman认为(75)，DC提呈凋亡细胞抗原的后果与DC成熟度有关，未成熟DC吞噬诱导免疫耐受反应，成熟DC吞噬则诱导免疫应答反应。需要指出的是，由于大部分研究将DC分离和抗原负载后进行体内注射或体外实验，DC有可能在分离过程中活化，从而诱导免疫应答反应。这种矛盾状况目前还没有很好的解释，但笔者认为用病毒诱导细胞凋亡不是一很好的模型，因为病毒感染后果很复杂（如不同病毒受体、作用细胞、淋巴因子谱以及对免疫的影响均不同）。因此笔者认为在讨论细胞凋亡对免疫影响时，目前可暂不考虑病毒感染作为凋亡诱导模型所得出结果(54，155，156)。因此，给予DC抗原负载同时如何保持其体内原位状态、防止活化是免疫学上一个重要问题。最近有人找到了体内抗原负载同时不活化DC的方法，用此方法在体内稳态下检测DC提呈抗原的后果，发现DC体内提呈抗原的结果是不是免疫应答而是免疫耐受，这给DC体内提呈凋亡细胞的抗原并诱导免疫耐受提供有力佐证(102)。另外一种情况是，凋亡细胞数量过大、巨噬细胞数量不足或功能不全，不能及时清除凋亡细胞，未被清除凋亡细胞产生继发性坏死而释放DC活化信号，使DC成熟而产生免疫应答性反应。目前在这方面的研究已有了直接证据，例如，Sauter等发现，尽管未成熟的DC对凋亡细胞和坏死细胞均能够吞噬，但是只有坏死细胞（或其上清液）才能够活化DC，表明细胞坏死后产生某种因子促进了DC的成熟,(59，103-105)。再者，细胞在凋亡前若先受到应激反应刺激也有可能诱发免疫应答反应(106)。
除巨噬细胞和DC之外，还有报道表明组织细胞（如肝脏中的LSEC等）也有一定的吞噬凋亡细胞的能力(82),这种吞噬能力是否伴有对免疫反应的调节仍有待于进一步研究(表1)。肝脏对衰老红细胞的清除也是通过Kupffer细胞的吞噬进行，静脉注射标记的氧化红细胞发现注射后30分钟，65%Kupffer细胞均吞噬1个或多个红细胞，PS脂质体可抑制Kupffer约80%的吞噬作用，表明这种吞噬作用也是通过Kupffer细胞上的PS受体进行的(157)。
（三） 分泌抑制性淋巴因子
凋亡细胞及其被吞噬后，何种因素介导了免疫抑制或诱导免疫耐受呢？目前认为凋亡细胞或吞噬细胞分泌的抑制性淋巴因子起着重要作用。TGF-β是一种广泛存在、具有免疫抑制作用的淋巴因子。证据表明，凋亡T细胞和肝细胞本身能够释放未活化和活化（后者具有免疫抑制活性）TGF-β，但mRNA转录没有上调，说明凋亡细胞释放细胞内已经存在TGF-β，而非新合成的（TGF-β是由三个异构体（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）构成的家族。其中TGF-β1的研究较清楚，发现其有广泛作用：抑制细胞的生长和分化，调节免疫和炎症反应，调控基质沉积、创伤愈合以及细胞的游走和粘附等(158)。TGF-β的受体由Ⅰ型和Ⅱ型两个亚单位，二者形成二聚体）。由于TGF-β在细胞内一般以未活化形式存在，因而细胞凋亡时必定有某种因子活化了TGF-β，这可能与细胞内反应性氧分子（reactive oxygen species）及线粒体的跨膜电位改变有关。
10年前即已发现小鼠B淋巴细胞瘤细胞凋亡后可产生体TGF-β1，此后发现其它很多凋亡细胞也可释放TGF-β1(107)。体外实验表明，吞噬凋亡细胞后，巨噬细胞分泌炎性因子如生长因子、细胞因子和化学因子等减少，抑制作用可被抗TGF-β1单抗中和(108，109)。体内注射凋亡细胞后炎性因子的分泌减少和炎症反应也减轻,从炎症部位分离的巨噬细胞可分泌TGF-β1。体内注射凋亡细胞后，巨噬细胞分泌TGF-β1明显增加，而注射活细胞没有影响。有趣的是，虽然巨噬细胞的吞噬对于TGF-β1分泌是重要的，但是，调理细胞（非凋亡细胞，但通过调理后产生的Fcγ受体可介导细胞吞噬）虽然也可被吞噬，但不能刺激巨噬细胞产生TGF-β1。不表达PS凋亡细胞（如Jurkat细胞、PBL-985细胞）也不能诱导TGF-β1产生。转染PS后PBL-985细胞可诱导TGF-β1,提示PS介导吞噬作用对于诱导巨噬细胞产生TGF-β1是至关重要的(110)。输血诱导移植物免疫耐受模型中，移植物内TGF-β1表达增高，用TGF-β1抗体可使移植物排斥，证明这种免疫耐受可能与移植物内高表达TGF-β1有关(111，112)。
如前所述，肝脏是体内吞噬凋亡细胞的主要器官，Kupffer细胞是肝内主要吞噬细胞。假如TGF-β1是肝内吞噬细胞介导免疫调节作用的主要分子，则Kupffer细胞应该能够分泌TGF-β1。在正常成年动物的肝脏内发现，Kupffer和LSEC细胞含有较多TGF-β1 mRNA，而TGF-β2和TGF-β3 mRNA 含量较少，而肝细胞几乎不含有TGF-βmRNA(113)。
（四） 理论模型
前面从微观角度分析讨论凋亡细胞调节免疫耐受的细胞和分子机制，但机体为何要启动凋亡细胞诱导免疫耐受这一过程呢？从传统观点来看，凋亡细胞作为自身抗原一部分应该是天然耐受，没有必要专门启动凋亡细胞诱导耐受程序。要深刻认识这一点，还需从免疫识别模型谈起。
长期以来，免疫学被“自我非我”（又称克隆选择）学说所统治，该学说最早来源于1953年Medawar进行的新生小牛皮肤移植实验，1957年至1959年Burnet完成了“自我非我”学说由假说向理论的转变。该理论要点是：
①体内存在着具有各种不同受体的免疫细胞克隆，即细胞系 。
②抗原进入机体选择具有相应受体的免疫细胞克隆，使之活化、增殖和分化，最后形成产生抗体的细胞或免疫记忆细胞；
③胚胎时期某一克隆如接触到相应抗原（包括外来及自身），即被抑制或删除，称为禁忌克隆（forbidden clone）或禁系，机体由于丧失了针对这些抗原的特异性免疫细胞克隆，而产生免疫耐受；
④禁忌克隆可以复活或突变，成为能与自身成分起反应的克隆。该理论对于免疫学和移植学曾起到一定的推动作用，如移植学中的HLA配型理论和实践即受惠于“自我非我”学说。
数十年过去之后，人们逐渐发现该理论有明显缺陷：
①首先机体作为一个整体系统，与其周围环境存在着不间断物质与信息交换，免疫系统作为其中的一个子系统也应如此，并且维持一个动态平衡。而“自我非我”学说总体上用静止观点看待事物，认为决定免疫系统对某一特定抗原产生免疫应答或免疫耐受的根本，在于胚胎或出生后一段短暂时间内免疫系统是否曾接触到该抗原，而忽视了生物有机体复杂、多样、变化和动态平衡的特点；
②难以解释很多免疫学的现象，例如：哺乳动物在青春期身体有很多变化，伴随许多新分子表达（如乳汁蛋白等），但为何不患自身免疫性乳腺疾患呢？男性精子为何可毫无阻拦地进入到HLA明显不同的女性体内而不产生排斥反应？妇女不但可以怀孕HLA抗原与母体不相同、甚至血型都不同的胎儿，但为何不发生流产？而当这些胎儿长大成人时，再给母体移植器官却发生强烈排斥反应呢？虽然胎盘可作为一个物理屏障，却无法阻挡母体和胎儿之间的细胞交流,母体血液内可发现胎儿来源的细胞并可用于产前诊断(114)。同样是细菌，为何伤寒杆菌诱发强烈免疫反应以清除细菌，而肠道内正常菌群却得以“安居乐业”，并作为身体必不可少的组成部分呢？同样是病毒，为何有些病毒诱导强烈终身免疫（如天花）而有些病毒则可在动物“毫无知觉”情况下寄生体内（如呼吸道寄生的大量病毒，乙型肝炎携带者等） ?又为何同样是蛋白，注射蛋白可以诱导强烈免疫反应，而我们每日食用大量动植物蛋白，小肠内还富含丰富淋巴细胞，但免疫系统又为何视而不见呢？曾几何时，我们坚信免疫系统有防护“新生肿瘤”的作用，认为肿瘤所表达的“新抗原”分子必将被成年动物免疫系统所识别而排斥。只有当免疫系统功能降低，防护能力缺乏时才生长肿瘤。但人们发现一些非病毒相关肿瘤（如乳腺癌、肺癌等）发病率在免疫健全和免疫缺陷病人中没有差别(115)。裸鼠（T细胞和B细胞功能缺陷）肿瘤发生率和正常小鼠没有区别。更有甚者，转基因小鼠研究表明，肿瘤不但不诱发免疫应答反应，相反诱导免疫耐受(116-118)。因此，我们认为老年人易发肿瘤并不奇怪，因为“一部老机器当然比一部新机器容易坏”，由于年纪的原因各种致病因素的作用时间长，细胞老化等都有可能使老年人容易生肿瘤。事实上，老年人其它系统如心血管系统疾病的发病率更高。我们一般把器官移植术后肿瘤发生率增加归结于术后长期免疫抑制治疗引起的全身免疫功能降低，但实际上却有可能是我们所用的环孢素A或其它免疫抑制剂的直接致瘤作用(119)；
③“自我非我”学说关键依据是新生小牛皮肤移植实验，该实验得出的重要假设是胚胎或新生动物免疫系统发育不成熟，对抗原尚无区分“自我非我”能力，此时接受的所有抗原（包括外来抗原）认为是“自我”加以耐受，而在此时期内未接触到的抗原认为是“非我”而加以排斥，但已有证据表明胚胎和新生动物的免疫系统同样具有免疫应答反应能力，能产生和成年动物一样的免疫反应。这一发现给“ 自我非我”学说以致命一击，动摇了给整个“自我非我”学说的根基(120，121)。实际上，新生动物免疫细胞和成年动物相比，也许只有数量和功能上的差异，但并非本质区别，只要给予强烈一些的刺激照样可以诱发与成年动物同样的免疫应答反应(122;123) 。
那么决定免疫系统针对某一特定抗原的免疫反应方向的根据是什么呢？鉴于单独抗原本身不能引起免疫应答反应，1970年由 Bretscher/Cohn’s 提出了抗原的双信号学说，认为能引起免疫应答的抗原有两种特性，抗原的一端提供其特异性的决定簇，而抗原的另一端通过T细胞传递的“辅助”（help）信号。这一理论说明抗原决定簇本身并不能诱导免疫应答反应，而需要另外一个“辅助”信号(124)。1974年Zinkernagel等发现了T细胞活化的MHC限制性现象，即T细胞不能识别游离的抗原，而只能识别由MHC提呈的抗原(125)。据此，1975年Lafferty和Cunningham’s修改了Bretscher和Cohn的学说，提出对T细胞的活化必须具备两个方面条件: 其一是由抗原递呈细胞表面的MHC-抗原肽复合物与T细胞表面的TCR形成的第一信号途径；其二抗原提呈细胞同时还必须提供一个辅助刺激信号以活化相应T细胞克隆，否则将不能诱导免疫应答反应，主要思想是T细胞需要共刺激信号以帮助增强抗原信号的活化能力，同时明确了辅助刺激信号来自于抗原提呈细胞。但继续研究发现，若仅仅有抗原信号而没有共刺激信号，提呈的抗原不但不能诱发免疫应答反应，相反可诱导免疫耐受。这一发现表明免疫反应的根本并非抗原本身的性质，因而对“自我非我”学说提出质疑。此后整个免疫学界和移植界都欣起了研究共刺激信号的热潮，但要彻底否定“自我非我”学说必须解释两个基本问题：共刺激信号的来源和活化方式。1994年Matzinger提出“危险理论”（danger model）引起了免疫学界和移植学界震动。该理论核心是：免疫系统并不关心其所接触的抗原是否“自我非我”，而是关心其是否受到损害（即是否存在危险信号）；若机体组织受到伤害则产生危险信号活化抗原提呈细胞，使其在提呈抗原同时提供共刺激信号，从而激活免疫系统产生免疫反应；若机体未受到伤害，则在提呈抗原同时不提供共刺激信号，而诱导免疫耐受(126)（图7）。该理论中，危险信号来源是其关键，若不能成功地找到危险信号则难以令人信服。Matzinger认为危险信号来自自身组织死亡方式：细胞凋亡没有危险信号释放，抗原提呈细胞不被活化，因而在其提呈时不伴有共刺激分子的表达，结果诱导T细胞免疫耐受；在感染、外伤、排斥反应等情况时细胞发生坏死，释放危险信号，活化抗原提呈细胞表达共刺激信号，诱导T细胞免疫应答。过去几年，许多研究者都投身到了寻找危险信号的行列中，相继发现感染、细胞坏死、细胞损伤均可诱导抗原提呈细胞成熟，使其表达共刺激信号，并发现热休克蛋白、补体、DNA和RNA等均可作为共刺激信号(127-132)。
Matzinger 危险信号理论比较成功地解释了坏死细胞为何能诱导免疫应答反应，能够解释更多免疫学现象，如移植排斥、肿瘤等，但对于凋亡细胞为何诱导免疫耐受解释似乎过于简单：即细胞凋亡时没有危险信号释放，抗原提呈时若没有危险信号则默认模式即是免疫耐受。本文前面分析表明，凋亡细胞在免疫反应过程中并非被动角色，而是通过特异性吞噬、释放抑制性淋巴因子主动地诱导了对凋亡细胞内自身分子的免疫耐受，这进一步拓展了Matzinger思想。若由于种种原因凋亡细胞过多或清除能力下降致使凋亡细胞未被及时清除，则凋亡细胞有可能发生继发性坏死，从而释放危险信号导致免疫应答反应。缺血、外伤或感染等均存在直接导致细胞坏死（或损伤）的因素，因而可以直接活化抗原提呈细胞导致免疫应答反应。据此，我们提出了以抗原提呈细胞吞噬为中心的凋亡细胞免疫调节模型（见图）。该模型与Matzinger的危险信号理论有相通之处，但不同的是强调了在体情况下凋亡细胞的主动性免疫耐受诱导作用，而在Matzinger的理论认为凋亡细胞仅仅是无“危险信号”的释放（而非主动性免疫耐受调节作用）(133) 。
图8 凋亡细胞免疫调节模型。凋亡细胞诱导免疫耐受而坏死细胞引发免疫应答反应。凋亡细胞膜表面表达特殊分子，被吞噬细胞（巨噬细胞或DC）相应受体识别，这导致凋亡细胞在其早期即被吞噬，凋亡细胞来源抗原被加工和提呈给童贞T细胞。由于凋亡细胞或吞噬细胞分泌抑制性淋巴因子，凋亡细胞抗原不但不引起免疫应答反应，相反诱导免疫耐受。另一方面，如果凋亡细胞过多，超过吞噬细胞吞噬能力，则会出现凋亡细胞聚集和继发性坏死，一些感染也可直接导致细胞坏死。这些坏死的细胞将释放“危险信号”以刺激免疫系统，因此当这些细胞碎片最终被吞噬细胞所吞噬时，其细胞上抗原必将被有效提呈，同时在共刺激信号作用下活化相应T细胞克隆，产生免疫应答反应。
七、 凋亡细胞调节免疫意义与临床应用
根据以上模型，我们可以清楚明了地解释一些免疫学基本问题。
① 在体内容易诱导免疫耐受的部位，也基本上存在大量凋亡细胞，如肠道 、胸腺、眼前房和肝脏等，这些部位凋亡细胞有助与于免疫耐受诱导。
② 成年动物妊娠对其母体来说不是一个危险信号，而且在滋养层有大量凋亡细胞，胚胎发育过程当中也伴随有大量细胞凋亡，这些凋亡细胞有助于免疫耐受诱导。同时这也解释了为何胚胎或新生动物易于诱导免疫耐受的原因（笔者认为，胚胎或新生动物仅仅是易于诱导免疫耐受，而非“自我非我”学说所认为的“胚胎接触抗原的结果一定是免疫耐受”）。
③ 在体内细胞凋亡可发生在各个组织器官，但凋亡细胞尤其是血液细胞如中性粒细胞、淋巴细胞和衰老红细胞等主要在肝脏被清除，肝脏在凋亡细胞诱导免疫耐受中扮演着重要角色。因而不难理解为何门静脉注射更容易诱导免疫耐受、肝移植更容易诱导免疫耐受等免疫学现象。
④ 在体内不同性质感染后果不同，一些病毒感染（如呼吸道病毒感染、HIV感染等）使患者抵抗力降低（白细胞降低，并易继发细菌感染），这些病毒很可能诱导了宿主细胞凋亡而抑制了免疫应答能力(134)。而一些机体不易清除而形成慢性携带的病毒（如乙型肝炎病毒等）则有可能是这些病毒诱导了局部组织或器官的细胞凋亡诱导了局部免疫耐受。一些病毒和细菌可引起强烈免疫反应，如天花病毒、伤寒杆菌等，这些病毒和细菌均可导致严重组织坏死，因而诱发强烈免疫应答反应。寄生虫之所以易在宿主体内生长，是由于它主要在细胞外生长，不引起细胞坏死（有些甚至引起凋亡），凋亡细胞在吞噬时分泌TGF-b等抑制因子抑制了局部免疫反应，易于诱导免疫耐受而促进寄生虫感染(78)。
⑤肿瘤在其生长过程中不引起细胞坏死，而且有一些肿瘤由于生长过快，部分细胞缺血引起凋亡相反可诱导局部免疫耐受，所以尽管有一些新“肿瘤标志物”表达，但并不引起免疫应答反应。这也是为何肿瘤病人一般均无觉察，只有当肿瘤生长到一定程度对周围组织产生压迫或损伤时才产生相应症状的原因。相反若肿瘤在生长和浸润过程中对组织产生了破坏，则产生了危险信号活化免疫系统产生针对肿瘤的免疫反应(135)。在清除肿瘤的同时使其细胞坏死则有可能激活免疫系统，帮助清除肿瘤。已有证据表明，将巨噬细胞与坏死肿瘤细胞共培养有助于清除肿瘤，相反若巨噬细胞与凋亡细胞共培养则促进肿瘤生长(136)。在肿瘤周围常常可以发现TGF-b表达，这可能就是肿瘤局部免疫耐受的分子基础(137-139)。
⑥如前所述，自身免疫性疾病中至少有部分机制是由于凋亡细胞未能及时清除，细胞继发坏死而释放“危险信号”激活免疫反应。
⑦移植时由于供者器官在切取和保存过程中存在缺血和缺氧导致细胞损伤，而且移植外科手术本身有大量细胞组织被切割、电灼等致组织坏死而释放“危险信号”，因而易于引起移植物排斥。如我们所熟知的补体，虽然我们已知它是攻击细胞的重要分子，但是它对移植器官的破坏却不是直接作用，而是作为危险信号活化免疫细胞，通过免疫细胞攻击移植物(140-143)。既往经验告诉我们，无血缘关系的非亲属活体肾移植即使HLA配型不如尸体移植，效果也优于尸体肾移植，侧面提示热缺血和冷缺血时间在移植物排斥反应中的重要性(144，145)。虽然我们可以在切取、保存以及手术过程中尽量减少损伤，要做到完全避免损伤是不可能的。那么我们有没有其它下调危险信号的方法呢？我们认为输注供者凋亡细胞或者在给予供者抗原的同时使用细胞凋亡诱导剂是诱导免疫耐受策略之一。已有报道若给予供者抗原的同时给予细胞凋亡促进剂如雷帕霉素(Rapamycin)则有利于免疫耐受的诱导，相反若给予环孢素A阻断细胞凋亡则妨碍免疫耐受的诱导(146-148)。笔者的课题组近年来也做了这方面的尝试，发现：（a）凋亡细胞诱导剂单独使用即可诱导大鼠心脏移植物长期存活；（b）在对受者不用任何免疫抑制剂情况下，凋亡供者脾细胞可延长大鼠心脏移植物存活，尤其引人注目的是凋亡供者脾细胞能诱导大鼠肝脏移植物长期存活（达1年以上），而不需要对受者使用任何免疫抑制剂（孙尔维等，未发表资料）。与此类似的是，骨髓移植模型中，给予凋亡细胞（不管是自体、同种异体、第三者或是异种来源）可提高骨髓移植成活率(149)。
⑧免疫耐受和免疫应答反应是由细胞因子进行精细调控的，细胞因子是细胞分泌作用于细胞之间的分子，由于这些因子作用距离短（内分泌和神经系统是长距离调节系统），因而免疫耐受和免疫应答是局部反应，这就说明了为何脚癣感染仅表现为腹股沟淋巴结的肿大，而肠道对某些正常菌群耐受并不影响其它部位的免疫应答反应。
八、 结论和今后研究策略
数十年来建立在“自我非我”学说基础之上的免疫学和移植学，认为免疫应答和免疫耐受的关键是机体内是否存在抗原特异性的免疫细胞（主要指T细胞和B细胞）克隆，因而治疗上也主要采用免疫抑制的方法。随着对免疫识别本质认识的不同，笔者认为针对不同的情况应采取不同的策略。
① 在许多情况下，免疫反应是一个局部事件，通过局部的淋巴因子传递控制信号。这有两个方面的意义，一方面免疫反应是一个非常强烈的反应（为了与感染病原体抢速度，特异性克隆在3～5天内增殖达1000，000倍），因此必定在反应初始阶段即存在局部淋巴因子高浓度，这样既可以在局部形成快速反应又不引起全身副作用；另一方面免疫反应是多种细胞与淋巴因子序贯参与。而曾经风行一时的全身应用淋巴因子免疫治疗效果不佳的原因可能是：难以在避免全身副反应情况下达到局部治疗浓度；其次淋巴因子作用复杂，往往随着免疫反应的不同时相而有不同作用，单一淋巴因子量的变化也难以撼动免疫反应的整个淋巴因子网络。如人们曾认为IL-2是T细胞增殖因子，但期望注射IL-2增强抗肿瘤效果，但未能如愿。实际上IL-2作用复杂，除了免疫反应初期担当T细胞增殖因子外，还在免疫反应过后担当T细胞诱导凋亡剂以清除过时T细胞克隆，IL-2基因敲除小鼠不但没有免疫低下，相反出现活化T细胞积聚和自身免疫性疾病(150)。FasL是公认细胞凋亡诱导分子，但在免疫反应早期，它扮演细胞增殖因子的角色(151)。因此，我们应该慎重对待应用或转染某种淋巴因子调节免疫反应的想法。
②免疫学目前的状况是知道较多，但理解甚少。现阶段仍难以找到有效调节免疫反应的手段，免疫耐受的诱导也仅仅停留在小动物实验阶段。因此全身应用免疫抑制剂仍是今后一段时间内不可或缺的治疗手段。但是应用凋亡细胞诱导免疫耐受给我们提供了一丝曙光：凋亡细胞在体内特异性地被吞噬细胞吞噬和清除，在其清除过程中不但抗原可被提呈，而且有抑制性淋巴因子的分泌，从而诱导免疫耐受。由于这是生物体在进化上保守的重要生命现象，凋亡细胞被吞噬后所引起的细胞和局部淋巴因子的变化必定是序贯和程序化的，对免疫耐受的诱导应该是效果好和副作用小。因此今后对于凋亡细胞的研究不应仅限于其凋亡机制，对其吞噬清除和调节免疫的机制需要进一步阐明，从中寻找出关键环节加以控制。在自身免疫性疾病发生机制中要注意是否存在自身凋亡细胞过量或吞噬清除功能降低情况，找出及时清除凋亡细胞方法。同时进一步研究在移植中凋亡细胞诱导免疫耐受的可能性和方法(91，152，153)。
③ 在疫苗研制、抗体制备或肿瘤防治等需要诱导强烈免疫应答反应时，应注重对不同佐剂研究。以前的佐剂主要是一些细菌代谢产物，能否寻找细胞内某种成分作为佐剂，以提供更多危险信号。在肿瘤治疗中，现有一些方法（如微波凝固治疗）可以在清除肿块的同时提高免疫反应，并且降低肿瘤的复发率、延长患者的生存时间。
④ 在病毒感染等能引起细胞凋亡的感染中，除了清除病毒的治疗外可考虑阻断细胞凋亡、吞噬或抑制性淋巴因子的分泌，以达到多提供危险信号活化免疫系统以加强清除病毒的能力。
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本人认为，这篇文章的思路还是很不错的。
摘要：细胞凋亡的发现是生物和医学研究领域的里程碑，大量的研究证明细胞凋亡在生命过程中具有重要意义。免疫耐受是指机体对自身或外来抗原不产生损害性免疫反应，它也是免疫学和移植学的难题，诱导器官移植免疫耐受是近50年来移植学家的梦想。本文通过对近年来细胞凋亡和免疫耐受这两个方面的研究分析，认为：①凋亡细胞不仅仅是死亡细胞，同时在其死亡和被清除的过程中对免疫具有抑制性调节作用；②肝脏是体内清除凋亡细胞和诱导免疫耐受的场所；③吞噬细胞的状态对凋亡细胞的免疫调节作用有至关重要的影响；④凋亡细胞调节免疫可能是通过其本身或吞噬细胞分泌抑制性淋巴因子；⑤凋亡细胞诱导免疫耐受有重要的生理、病理和治疗意义，给移植免疫耐受的诱导、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的治疗带来新的希望。
细胞凋亡是生物界一种普遍现象，研究证明：①细胞凋亡既是一正常生理过程，参与生物体的各个阶段，包括生长、发育、衰老等，同时它也在很多疾病发生机制中起重要作用(1)；②细胞凋亡是一主动、程序化与耗能过程，是机体对衰老、病变或过时细胞的主动清除，它涉及到一系列“自杀性”酶的序贯活化和参与，最终由吞噬细胞将其吞噬并毫无痕迹地清除；③凋亡细胞形态学上最显著特征是磷脂酰丝氨酸（phosphtidylserine, PS）外翻、细胞膜皱缩以及核固缩、断片化等；④凋亡细胞碎片不直接释放到周围组织间隙，而是形成带有完整胞膜的凋亡小体，并且很快被吞噬和消化以免其内容物被释放到周围环境而造成损害；⑤细胞凋亡后由健康细胞补充，无需启动以纤维增生和瘢痕形成为主的修复反应。相反，细胞坏死是生命过程的偶然事件，一般发生在组织器官血供突然中断（栓塞）、感染或外伤等情况下。坏死是一非程序化被动过程，表现为细胞能量代谢突然终止、细胞肿胀、胞膜破裂、内容物释放到周围环境，其结果往往导致局部炎症反应，进而激活特异性免疫反应，并可能导致自身免疫性疾病(2)。坏死细胞缺损区域往往由体内修复系统修复，但是这种修复的性质是“抢救性”的，主要表现为成纤维细胞增生和纤维瘢痕形成，目的是尽快填补坏死区域，以保护周围健存的组织细胞。细胞凋亡的生理性、主动性和程序性提示了对其过程的可控性，因而燃起人们一种希望，即通过系统揭示细胞凋亡分子机制，找到一些干预措施控制细胞凋亡或拯救凋亡细胞，达到治疗疾病目的，这已成为近几年细胞凋亡研究领域主要方向。
有关细胞凋亡研究应该还存在另一个重要方向，即凋亡细胞是如何被识别、吞噬及清除的，以及此过程对其他细胞、组织和系统有何影响？这方面研究虽有一些报道但其广度和深度还远不及细胞凋亡分子机制研究 。但这一研究方向可能更为重要、更有意义。如前所述，人们普遍注意到凋亡细胞早期表现主要是两个方面：其一是胞膜皱缩、PS外翻等细胞膜变化；其二是核固缩、DNA断片化等细胞核变化。第一方面变化的意义显而易见：细胞膜皱缩与PS外翻可将凋亡细胞与健康细胞分离并表达“清除（eat me）”信号，意义是告之周围吞噬细胞：“本细胞已经死亡请尽快吞噬予以清除”(3)。为何凋亡细胞需要及时清除呢？这是由于凋亡细胞已丧失主动获取能量并完成代谢过程的能力，剩余能量供应有限，不能长时间维持主动耗能过程，若不及时清除则细胞膜破裂、内容物释放而导致周围组织与细胞的炎症与损害。然而，第二个方面变化似乎有些难以理解，即凋亡细胞被吞噬之前为何要启动一个主动耗能过程来将核染色质消化、DNA 断片化呢？我们知道，为了保证凋亡时能将核染色质充分降解，每一个组织细胞都需装备一套酶系统，而且这一系统中的各个要素在活细胞中既要维持一定张力又要保持非活化状态，细胞凋亡时还要再耗费一定能量激活该系统以实现对核质消化。现已查明，细胞确已装备了这样的酶系统（如CASPASES酶系），并在凋亡时激活，同时这一酶系在进化上相当保守 (在线虫、果蝇和哺乳动物的细胞均存在)，表明它是生命活动中一个基本和重要组成部分。然而，一旦细胞“被判死亡”，其胞内物质清除方式对凋亡细胞本身并不重要，而巨噬细胞是专业性吞噬细胞，胞内含有丰富降解酶系，通过巨噬细胞吞噬凋亡细胞并将细胞内容物降解比较合理。那么如何解释细胞装备一套如此复杂的“自我降解与消化酶系”以备“凋亡时不时之需”呢？这并非为了凋亡细胞本身，而是为了其周围健康细胞。细胞凋亡后到其被吞噬细胞吞噬之间存在一定的时间延迟，在此期间被细胞膜包裹的细胞核及一些细胞器，如果不加控制地释放到细胞外环境，会对组织细胞产生严重损害。这些损害主要有两个方面：其一是这些碎片通过对周围内环境的改变而直接损伤。其二是诱发自身免疫性疾病，凋亡细胞若未及时被吞噬细胞清除（这种情况在生理状态下一般不存在，但在某些病理情况下如SLE、病毒感染等时可能存在），除了引起局部炎症反应外，由于吞噬细胞（主要是巨噬细胞和树突状细胞，dendritic cell, DC）均为抗原提呈细胞，凋亡细胞被吞噬后其胞内和核内存在的抗原物质有可能被提呈，从而激活相应T细胞而引起自身免疫性疾病。因此机体及时清除凋亡细胞除了腾出空间以补充新的、健康的和有功能的细胞以及将凋亡细胞生物原料再利用等外，同时也是要防止自身抗原被“不适合地提呈”发生诱导自身免疫性疾病。
当一种抗原被抗原递呈细胞表面的MHC-抗原肽复合物提呈时与T细胞表面的TCR形成的第一信号途径，免疫系统对此抗原的反应主要有三种：免疫活化、免疫忽视、免疫抑制。凋亡细胞直接活化免疫细胞可能性很小，因为身体内每天均有大量凋亡细胞（如胃肠道粘膜上皮细胞的脱落、胸腺T细胞凋亡、白细胞凋亡等），但自身免疫性疾病很少。然而，若凋亡细胞因未被及时清除而坏死(4)，则有可能活化免疫细胞而发生自身免疫性疾病，如SLE等（见后述）。仅仅免疫忽视对机体并非万全之策，因为感染或外伤时会有大量活化抗原提呈细胞和淋巴细胞，若此时体内仍存在大量凋亡细胞，活化免疫相关细胞和淋巴因子可能通过旁刺激作用激活针对凋亡细胞抗原的T细胞克隆，使其增殖而导致自身免疫性疾病。笔者认为，凋亡细胞在其清除过程中防止产生自身免疫性疾病的万全之策是局部免疫抑制，使相应T细胞克隆灭能或删除，以产生对凋亡细胞抗原免疫耐受，在此情况下即使存在其它活化抗原提呈细胞或T细胞的因素也难以产生自身免疫性疾病（见图1）。
许多事实证明凋亡细胞的确具有免疫调节作用以抑制局部免疫反应，从经典的临床输血实践到自身免疫性疾病的发病机制研究，以及移植免疫耐受的进展等都有相应报道，本实课题组的研究还表明，凋亡细胞不但能抑制Ｔ细胞活化，而且其调节免疫特性在进化上保守，凋亡细胞能够诱导移植免疫耐受(5)。因此研究凋亡细胞被吞噬的机制以及其对免疫系统的影响不但有助于我们认识自身免疫耐受与自身免疫性疾病的发病机制，而且对临床上寻找相应治疗策略和诱导移植免疫耐受有重要意义。
一、 临床输血给我们的启示
输血已有数十年历史，在医学实践尤其是外科领域中扮演重要角色。虽然输血主要目的是补充血液成分尤其是红细胞，以提高机体携氧能力，但令人不解的是,为何输血能导致免疫抑制呢?
早期临床观察发现输血可以增加外伤及手术后感染，输血量与感染发生率呈正相关，若输血少于3～4单位，则感染发生率显著降低，输血也可减少手术后自身免疫性疾病复发。移植界对输血的认识过程是曲折的，早期人们担心输血可能会使受者免疫细胞对供者抗原产生致敏、移植物出现加速排斥而不敢输血。1973年Opelz发现输血不但不会诱发加速排斥反应，相反可以延长移植物存活时间，到20世纪70年代末现输血优越性得到公认，此期间至环孢素A问世前移植医生普遍认为移植术前给受者输3～4单位全血对术后移植物存活有益，因而一时术前输血成为不少移植中心的常规(6, 7)。但环孢素A应用后输血效果显著降低，人们不清楚是环孢素A的显著免疫抑制作用相对抵消了输血效果呢？还是环孢素A能够直接抑制输血的作用 ？除了上述临床观察提示输血可能导致免疫抑制外，免疫学监测进一步肯定了输血的免疫抑制作用，如输血后受者NK、T细胞的增殖能力降低，而T抑制细胞的活性增加等。那么输血导致免疫抑制的原因是什么呢？由于临床输血中大部分是异体血，因此有人提出输血的免疫抑制作用也许来源于血液的异体性质，这一观点已被否定。因为对照自体输血和异体输血的结果发现，两者均有相似的免疫抑制作用，输自体血和异体血的感染发生率并没有差异(8)。人们进一步探讨了输血成分对免疫的影响，发现输全血或血浆均有免疫抑制作用，而输红细胞或去除白细胞的血液制品则免疫抑制作用较弱，表明免疫抑制作用来源于血液中的白细胞或血小板。为何白细胞及血小板在体内没有免疫抑制作用，而一旦离体保存后却具有免疫抑制作用呢？一个合理的猜测是血液离体后，白细胞和血小板的生存环境改变，使其发生凋亡，而正是这些凋亡细胞产生了免疫抑制。储存红细胞和血小板中确实存在粒细胞和淋巴细胞凋亡，因而间接支持了上述观点(9-11)。
二、 肝脏免疫特殊现象与凋亡细胞的关系
肝脏是人体最大消化和代谢器官，每日吸收营养物质，通过肝脏分解、加工和合成后转运到全身组织，同时全身一些代谢产物和毒性物质也在肝脏解毒，另外肝脏还产生胆汁以帮助消化吸收脂肪。然而大量事实证明肝脏在免疫方面有着明显独特性，而且这种特性中至少部分与凋亡细胞有关(12)。众所周知，肝脏易于诱导免疫耐受，若通过门静注射供者白细胞，可诱导皮肤、肝脏、胰腺、小肠等移植物耐受，甚至在异种移植也有通过门静脉注射诱导免疫耐受的报道(13-17)。若将移植物静脉与门静脉吻合可诱导移植物耐受，相反将移植物静脉与腔静脉吻合则免疫耐受丧失(18-20)。口服免疫耐受是免疫学的一个重要现象，然而作门腔分流后口服免疫耐受丧失(21)。在一些同种异基因肝移植动物模型（小鼠、部分大鼠和猪）中，受者可不用任何免疫抑制剂而移植物长期存活(22)。肝脏移植可逆转其它移植物排斥反应(23)。临床工作中发现，肝移植时HLA配型对移植物存活的影响没有肾移植和心脏移植那么显著，肝脏若与其它器官一起移植则可降低其它器官排斥发生率，部分肝脏移植病人也可完全停用免疫抑制剂而长期存活(24，25)。
脂多糖（LPS）是细菌内毒素的重要组成部分，是细菌刺激机体产生炎症和免疫反应的重要分子，免疫学上多被用作免疫反应辅助刺激因子(26)。已证明LPS（及其它炎性因子，如TNF-α、CD40L等）可诱导DC成熟产生共刺激信号，进而激活特异性免疫应答反应以清除细菌(27，28)。但是LPS对肝脏作用令人奇怪。因为在生理状态下发现门静脉内存在LPS（浓度达到10pg/ml）(29，30)，而这些LPS并未对肝脏产生炎性刺激反应或诱导局部免疫应答反应，尽管在门静脉内含有。相反，门静脉内LPS既刺激Kupffer细胞产生IL-10，又下调LSEC抗原提呈作用(30;31)。而LPS与LSEC体外培养，同样下调肝血窦内皮细胞（liver sinus endothelial cell, LSEC）的抗原提呈功能，减少LSEC表达MHC II、CD80和CD86(32)。虽然LPS也可刺激Kupffer细胞产生TNF-α，但如此产生的TNF-α对LSEC抗原提呈作用不是上调，而是下调(33，34)。
肝脏作为代谢器官，每日处理大量外来抗原、代谢产物以及毒物。肝脏除了接受胃肠道和动脉系统血液外，还接受脾静脉血液。其中脾静脉血液极有可能含有大量活化或凋亡淋巴细胞（见图2）。因此，肝内需要强有力调节机制以防止免疫反应“过度”导致肝脏和机体损伤或引起自身免疫性疾病。肝脏具有如此免疫特殊性的机制是什么呢？早期人们曾认为肝脏抗原性较弱，不能引起强烈免疫反应，因而称肝脏为免疫特惠器官（immune privileged）。然而分离纯化的肝细胞有相当数量MHC I类抗原表达，体外实验表明肝细胞可以刺激脾细胞产生CTL，用海绵作为基质行肝细胞体内移植实验发现肝细胞同样能刺激动物免疫系统产生CTL(35，38)。另一观点认为，肝细胞虽然可表达MHC I，但肝细胞与血窦之间有LSEC和Kupffer细胞阻隔，使其难以接触到淋巴细胞（图3）。但是LSEC和Kupffer细胞本身不但表达MHC I，而且可表达MHC II。无论从抗原提呈的能力和细胞数量（LSEC占肝脏细胞的30%，而Kupffer细胞占全身吞噬细胞80% ），如果没有受到其它某种因素控制，这两种细胞本身即足以诱发排斥反应(36)。另一方面，肝脏虽然易于诱导免疫耐受，但同时也具有强大免疫应答进行抗感染的能力。进入血液中大部分细菌均在肝脏内被杀灭，病毒性肝炎时产生的CTL可杀伤病毒感染肝细胞，分离培养的肝脏T细胞具有CTL杀伤和产生淋巴因子能力，这些都表明肝脏并非免疫特惠器官而是一特殊免疫器官(39-41)。
既然肝脏并非免疫特惠器官，那么何种原因使得肝脏在免疫方面具有如此特性而易于诱导免疫耐受呢？数十年来，Starzl提出的“微嵌合体”学说占据了移植界统治地位。该学说是指移植后肝脏中白细胞游走至受者全身组织器官中，这些细胞在受者体内形成微嵌合体，而这些微嵌合体诱导了受者对供者免疫耐受。主要依据是：①移植后耐受的部分临床受者的全身组织器官中发现了供者来源细胞（即“微嵌合体”）；②肝脏中发现一类特殊类型DC，其共刺激信号较弱，可能易于诱导免疫耐受(42-45)。但这一学说也有很多疑点：①理论上，受者体内淋巴细胞仅在淋巴组织和器官中循环（如淋巴结、脾脏等），供者抗原提呈细胞要诱导免疫耐受首先必须有机会接触到受者淋巴细胞，同时要保持其未活化状态，要做到这一点最好的办法就是驻留受者的淋巴器官；②生理情况下，未活化的抗原提呈细胞一般驻留在周围组织，活化后迁徙到附近淋巴组织。肝移植后如何呢？迄今证据表明，“微嵌合体”并非特异性地驻留受者淋巴组织，而是随机分布到全身组织器官。由于淋巴细胞一般不会浸润到周围组织（除非在炎症或排斥情况下），因此“微嵌合体”细胞接触到受者淋巴细胞的机会“微乎其微”； ③从肝脏中游走的抗原提呈细胞相对于受者全身淋巴系统其数量极少（受者体内要用PCR方法才能检测到），也没有证据表明这些细胞在受者体内会分裂、增殖。设想如此微量抗原提呈细胞又如何能诱导受者强大免疫系统免疫耐受呢？④如果供者细胞能够起一定的作用，那么肝移植时移植物本身也可视为一个“巨嵌合体”，移植肝内供者抗原似乎更有机会接触到受者淋巴细胞（因为有丰富的血供和淋巴回流），因而也更有可能诱导免疫耐受。而肝脏内细胞能够接触到童贞（naive）T细胞则提供了肝脏诱导免疫耐受的可能性 。因此，肝脏移植后发现体内存在“微嵌合体”细胞这一现象，可能并非肝移植免疫耐受的原因，而是免疫耐受的结果或伴随现象，将它视作免疫耐受的检测指标有一定意义(46)。
显然上述种种假说难以令人信服地解释肝脏免疫特殊现象，迄今为止仍难以对肝脏免疫特殊性作出肯定性结论。新近证据表明肝脏是凋亡细胞处理场所，肝脏“微环境”对其免疫调节作用至关重要，其中Kupffer细胞或LSEC对凋亡细胞吞噬及其对局部免疫的调节作用可能有助于理解肝脏免疫特殊作用。下面将进一步从肝脏作为凋亡细胞清除场所这一新视角重新审视肝脏免疫特殊性（见后述）。
三、 自身免疫性疾病与凋亡细胞吞噬
自身免疫性疾病是威胁人类健康的一大类疾病，对其发病机制讨论很多，但仍未有肯定性结论。这是一类病因复杂的多基因疾病，其中除了遗传性因素以外，环境因素也有重要影响。对于自身免疫性疾病研究无外乎要解决两个方面的问题：其一是自身抗原来源，其二是免疫系统激活机制。过去几年发现：凋亡细胞是自身抗原重要来源，如引起系统性红斑狼疮（SLE）的自身抗原即来自凋亡细胞皱折(47)。若凋亡细胞未及时被吞噬和清除，则有可能激活免疫系统产生自身免疫性疾病(48，49)。
理论上，自身抗原可来源于细胞膜分子、可溶性分子或胞内结构性分子，但是健康细胞由于不表达“清除”信号因而不被吞噬细胞所吞噬，因而其抗原不易被提呈。而体内每日有大量凋亡细胞被吞噬，这些凋亡细胞上装配的分子很容易被吞噬细胞上MHC所提呈，因而凋亡细胞作为自身抗原有足够细胞和分子学基础(50，51)。自身免疫性疾病患者可产生针对细胞内抗原的抗体（如SLE等），这提示自身抗原来源于细胞本身(50，52)。用凋亡胸腺细胞免疫动物可产生自身抗体，则进一步证实了自身抗原来源于凋亡细胞的假设(50，53，54)。巨噬细胞或DC吞噬凋亡细胞后，细胞降解后所产生的短肽可装配到MHC分子槽中，而且由于不同蛋白酶活化，使得被T细胞忽视的一些隐蔽抗原得以提呈(47，55，56)。
所有自身免疫性疾病中系统性红斑性狼疮（SLE）研究最多。SLE累及全身多个系统，同时其临床和实验室检查表现也多种多样。其抗原来源也不局限于细胞内某一个成分，而是涉及到细胞多种成分，如细胞核、细胞浆和细胞膜。凋亡细胞或凋亡小体内存在SLE患者自身抗原，其中包括来源于细胞核和细胞浆的自身抗原(55，57)。正常生物体内每天均有一定数量凋亡细胞，凋亡细胞降解后的“自身分子”每天都有可能被装配到抗原提呈细胞的MHC分子槽中，但是为何没有发生自身免疫性疾病呢(58)？这表明凋亡细胞来源自身分子要成为“自身抗原”一定还存在其它的某种因素将“自身分子活化为自身抗原”（见后述）。一种解释是自身免疫性疾病患者清除凋亡细胞能力降低或缺乏，从而诱发自身免疫性疾病(59)。这已得到一些证明：①SLE患者巨噬细胞吞噬能力下降。C反应蛋白可与补体C1q结合并促进凋亡细胞清除，而SLE患者体内这两种分子均降低(60)；②目前已知补体尤其是C1q参与了凋亡细胞清除，C1q可特异性地与凋亡细胞表面皱折结合(61，62)，C1q缺乏不但可引起人SLE，而且可导致小鼠出现SLE样免疫变化。C1q缺乏小鼠肾小球凋亡细胞增加，且出现肾小球肾炎样改变(63-65)。C1q缺乏病人单核-巨噬细胞对凋亡细胞吞噬能力降低，而补充C1q则可纠正(66)。除了C1q外，**也有可能参加了凋亡细胞清除，因为**缺失小鼠同样存在对凋亡细胞吞噬功能的损害(66)； ③许多SLE动物模型巨噬细胞对凋亡细胞的反应与非自身免疫性疾病动物模型相比存在明显异常(67)。
另外一个研究较多的自身免疫性疾病是糖尿病，在其发病过程种胰岛β细胞炎症反应是一重要病理过程。那么导致这种炎症反应的原因是什么呢？BB鼠和NOD鼠分别是糖尿病自身免疫性大鼠模型和小鼠模型，检测这两种模型均发现胰岛β细胞凋亡增加，同时在这两种模型中也发现巨噬细胞存在明显异常：要么数量减少、要么在识别和吞噬凋亡细胞方面存在功能缺陷(68-70)。有趣的是对于化学方法制备的小鼠糖尿病模型，用抗CD40L抗体易于诱导对胰岛移植物免疫耐受 ，而同样处理方法难以逆转NOD小鼠糖尿病(71)，也提示凋亡细胞清除能力降低可诱发自身免疫性疾病。
四、 凋亡细胞对T细胞抑制作用
以上证据及分析提示凋亡细胞可能对T细胞功能存在抑制性调节作用，并且在进化上应该具有保守性。有没有直接证据支持凋亡细胞对免疫的调节作用? Ponner等发现与活细胞相比，凋亡细胞免疫原性明显减弱(72)。Matzinger等在实验中发现，虽然坏死细胞可以活化DC，但凋亡细胞很难活化DC，甚至对LPS都没有反应(73)（Matzinger,通信交流）。笔者实验室结果首次证实凋亡细胞对T细胞活化有直接抑制作用。我们将培养的人K562细胞在体外与FTY720共温育，发现凋亡率为90%，将此凋亡细胞加入到ConA刺激小鼠脾细胞增殖体系中，然后以CD69（T细胞早期活化指标）监测T细胞活化情况。发现在加入FTY720诱导凋亡K562细胞后，再用ConA刺激后CD69表达明显降低，表明FTY720诱导的凋亡细胞可以抑制ConA刺激后小鼠脾细胞活化。进一步研究发现，凋亡细胞免疫抑制作用并非FTY720或K562细胞株的特殊作用，因为我们用另外一种凋亡诱导剂（CHX）和另外一个细胞株（HL-60）进行实验取得了类似结果。这些结果表明，凋亡细胞的确对T细胞活化存在抑制作用(5)。由于K562和HL-60均系人细胞株，而我们加入的凋亡细胞是小鼠脾细胞，此结果还提示凋亡细胞对免疫的调节进化上保守性（图4）。我们同时还发现在体外混合淋巴细胞培养体系中，加入凋亡细胞可以抑制T细胞增殖(孙尔维等，未发表资料)。我们实验室进一步研究发现供者凋亡细胞还延长同种异基因移植物存活，甚至能诱导肝脏移植物长期存活（陈建峰，汪爽等，待发表）。提示应用凋亡细胞输注方法可能是诱导移植物免疫耐受的重要策略和方法，值得进一步加以研究。
五、 凋亡细胞调节免疫的其它证据
除前述证据外，其它研究也提示凋亡细胞与免疫抑制或免疫耐受有关。如紫外线照射可导致免疫抑制，该方法可治疗某些自身免疫性疾病，这与紫外线诱导了细胞凋亡有关。口服免疫耐受是免疫学的一个重要研究方向，有趣的是最近发现小肠上皮内有一类专职的DC（CD4- OX41- DC），专门从事将凋亡肠上皮细胞转运到引流肠系膜淋巴结的职能，并诱导T细胞对该DC提呈抗原的免疫耐受(74，75)。若将巨噬细胞与坏死肿瘤细胞共培养可大大增强巨噬细胞清除肿瘤作用，若与凋亡细胞共培养则不但不能清除肿瘤反而能促进肿瘤生长。FTY720是一个新型免疫抑制剂，其主要作用为诱导淋巴细胞凋亡。我们研究表明，给予FTY720可诱导大鼠同种异基因心脏移植物长期存活，提示细胞凋亡有可能用于免疫耐受的诱导。在眼前房（一个公认免疫特惠部位），如果单纯胞疹病毒感染后伴随有细胞凋亡，则可诱导局部免疫耐受；相反若被感染动物细胞不能启动凋亡程序（Fas或FasL缺失）则不能建立免疫耐受，表明细胞凋亡在眼前房免疫中起至关重要作用(76，77)。锥型虫（Trypanosoma Cruzi）病易于引起人持续感染，常合并心脏病理变化，主要感染细胞为巨噬细胞、心肌细胞等。该病在免疫学上显著特征是感染的同时伴有T细胞大量凋亡，而这种凋亡又促进了该寄生虫感染(78，79)。以上证据充分表明，凋亡细胞存在某种机制调节免疫、诱导免疫耐受。
六、 凋亡细胞调节免疫作用机制
综上所述，凋亡细胞具有局部诱导免疫抑制和免疫耐受作用。在生物体内凋亡细胞在何处调节免疫、那些细胞参与、何种分子介导和信号如何传递呢？弄清这些问题不但使我们能更清晰地理解凋亡细胞调节免疫作用机制，而且对免疫识别模型理解均有重要意义。
（一） 肝脏是特异性处理凋亡细胞的场所
肝脏是清除衰老红细胞主要场所，正常人每天大约有2.0×1012红细胞（约6.25克血红蛋白）需要清除，肝脏在清除红细胞同时还将其血红蛋白分解成氨基酸进行在利用。静脉注射氧化红细胞主要聚集在肝脏，注射后30分钟即有约30%被肝脏拦截(80)。中性粒细胞是机体抗感染的第一线细胞，具有数量大、反应灵敏特点，但在一些病理情况下，中性粒细胞也可对正常组织产生损害。中性粒细胞在体内代谢更新很快，血液中半衰期仅6小时，每天约有1.4×1010中性粒细胞凋亡，从而需要及时清除以维持机体抗感染状态稳定，而肝脏正是清除凋亡中性粒细胞的主要场所(81)。
肝脏作为体内清除衰老、死亡细胞场所有其独特点优势和意义。其一是肝脏血流量大（占循环血量25%）、肝内血流缓慢（肝窦内血流速度仅为一般毛细血管后小静脉的七分之一），由于血窦与肝板形成特殊结构，血液通过血窦时与肝脏内细胞接触面积大，血液中需要清除细胞很容易被肝脏拦截。肝脏是体内三大物质代谢场所，有丰富能量和酶系，细胞降解后物质容易被再利用。由于肝脏内同样有丰富淋巴循环（肝脏产生淋巴液约占胸导管20％～50%），有理由推断凋亡淋巴细胞也应在肝内被清除。新近证据表明肝脏确实是凋亡淋巴细胞积聚场所。给TCR转基因小鼠注射抗原，可在周围特异性地删除相应CD8+ T细胞克隆，而这些T细胞均聚集在肝脏并发生凋亡(82-84)。B220+是细胞即将凋亡的一个标志(85)，自发性糖尿病大鼠（BB鼠）B220+细胞聚集在肝脏，而周围CD8+ T细胞减少。虽然流感病毒侵犯部位主要局限在呼吸道，机体在与病毒对抗中产生的凋亡细胞不能在肺内被清除，而在肝脏内发现了大量凋亡CD8+T细胞(86，87)。 虽然肺泡内有相当数量的巨噬细胞，但它们并不能吞噬凋亡细胞。然而呼吸道面临大量感染性和非感染性颗粒的侵犯，巨噬细胞必定要对它们进行吞噬和处理，这提示对凋亡细胞的吞噬和对其它感染性及非感染性颗粒吞噬的细胞类型或机制不同(87)。通过肝脏灌流发现，肝脏还可特异性地拦截活化T细胞，并且在肝内诱导这些T细胞凋亡(84，88)。
（二） 巨噬细胞是吞噬凋亡细胞的主要细胞
何种细胞能够吞噬凋亡细胞，何种分子介导了吞噬作用呢？目前越来越多证据表明巨噬细胞是吞噬凋亡细胞的主要细胞。1985年Duvall等发现，将腹腔巨噬细胞与凋亡胸腺细胞共温育，巨噬细胞可与凋亡细胞特异性结合，证明巨噬细胞能特异性地吞噬凋亡细胞，并认为巨噬细胞这种特异性识别是通过其细胞表面凝集素样分子介导的。目前研究提示，在巨噬细胞表面有几种受体介导了凋亡细胞吞噬，如SR-A，CD36，CD14，ABC-1，PStR，MER，ICAM-3等，但究竟是何种受体起主要作用，还是数个受体协同作用仍不清楚（表1）(89-95)。除了吞噬细胞表面受体外，补体也是介导吞噬的一类重要分子，吞噬细胞上有补体受体而细胞凋亡时PS外翻能激活补体系统，补体缺乏不但损害吞噬细胞吞噬功能，而且可能是自身免疫性疾病的一个发病机制(96)。而这些吞噬受体在线虫、果蝇和人类均有发现，提示这些分子进化的保守性。Kupffer细胞是肝脏主要吞噬细胞，门静脉灌流活化淋巴细胞，10分钟后约有60%淋巴细胞与Kupffer细胞结合，90分钟以后则全部与Kupffer细胞结合(88)。氯化钆（GdCl3）是Kupffer细胞吞噬阻断剂，若给予氯化钆阻断Kupffer细胞的吞噬作用，则门静脉注射供者抗原诱导免疫耐受能力丧失(97-99)，进一步证明了肝脏Kupffer清除凋亡细胞的作用。也有证据表明DC能够吞噬凋亡细胞，但其对免疫反应的调节是诱导免疫耐受还是应答反应仍有争议。一些报道认为吞噬凋亡细胞的DC能够诱导免疫耐受，另一些则报道可诱导免疫应答反应(75，54，100，101， 31)。
为何DC对凋亡细胞吞噬和抗原提呈表现出如此的复杂性呢？Steinman认为(75)，DC提呈凋亡细胞抗原的后果与DC成熟度有关，未成熟DC吞噬诱导免疫耐受反应，成熟DC吞噬则诱导免疫应答反应。需要指出的是，由于大部分研究将DC分离和抗原负载后进行体内注射或体外实验，DC有可能在分离过程中活化，从而诱导免疫应答反应。这种矛盾状况目前还没有很好的解释，但笔者认为用病毒诱导细胞凋亡不是一很好的模型，因为病毒感染后果很复杂（如不同病毒受体、作用细胞、淋巴因子谱以及对免疫的影响均不同）。因此笔者认为在讨论细胞凋亡对免疫影响时，目前可暂不考虑病毒感染作为凋亡诱导模型所得出结果(54，155，156)。因此，给予DC抗原负载同时如何保持其体内原位状态、防止活化是免疫学上一个重要问题。最近有人找到了体内抗原负载同时不活化DC的方法，用此方法在体内稳态下检测DC提呈抗原的后果，发现DC体内提呈抗原的结果是不是免疫应答而是免疫耐受，这给DC体内提呈凋亡细胞的抗原并诱导免疫耐受提供有力佐证(102)。另外一种情况是，凋亡细胞数量过大、巨噬细胞数量不足或功能不全，不能及时清除凋亡细胞，未被清除凋亡细胞产生继发性坏死而释放DC活化信号，使DC成熟而产生免疫应答性反应。目前在这方面的研究已有了直接证据，例如，Sauter等发现，尽管未成熟的DC对凋亡细胞和坏死细胞均能够吞噬，但是只有坏死细胞（或其上清液）才能够活化DC，表明细胞坏死后产生某种因子促进了DC的成熟,(59，103-105)。再者，细胞在凋亡前若先受到应激反应刺激也有可能诱发免疫应答反应(106)。
除巨噬细胞和DC之外，还有报道表明组织细胞（如肝脏中的LSEC等）也有一定的吞噬凋亡细胞的能力(82),这种吞噬能力是否伴有对免疫反应的调节仍有待于进一步研究(表1)。肝脏对衰老红细胞的清除也是通过Kupffer细胞的吞噬进行，静脉注射标记的氧化红细胞发现注射后30分钟，65%Kupffer细胞均吞噬1个或多个红细胞，PS脂质体可抑制Kupffer约80%的吞噬作用，表明这种吞噬作用也是通过Kupffer细胞上的PS受体进行的(157)。
（三） 分泌抑制性淋巴因子
凋亡细胞及其被吞噬后，何种因素介导了免疫抑制或诱导免疫耐受呢？目前认为凋亡细胞或吞噬细胞分泌的抑制性淋巴因子起着重要作用。TGF-β是一种广泛存在、具有免疫抑制作用的淋巴因子。证据表明，凋亡T细胞和肝细胞本身能够释放未活化和活化（后者具有免疫抑制活性）TGF-β，但mRNA转录没有上调，说明凋亡细胞释放细胞内已经存在TGF-β，而非新合成的（TGF-β是由三个异构体（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）构成的家族。其中TGF-β1的研究较清楚，发现其有广泛作用：抑制细胞的生长和分化，调节免疫和炎症反应，调控基质沉积、创伤愈合以及细胞的游走和粘附等(158)。TGF-β的受体由Ⅰ型和Ⅱ型两个亚单位，二者形成二聚体）。由于TGF-β在细胞内一般以未活化形式存在，因而细胞凋亡时必定有某种因子活化了TGF-β，这可能与细胞内反应性氧分子（reactive oxygen species）及线粒体的跨膜电位改变有关。
10年前即已发现小鼠B淋巴细胞瘤细胞凋亡后可产生体TGF-β1，此后发现其它很多凋亡细胞也可释放TGF-β1(107)。体外实验表明，吞噬凋亡细胞后，巨噬细胞分泌炎性因子如生长因子、细胞因子和化学因子等减少，抑制作用可被抗TGF-β1单抗中和(108，109)。体内注射凋亡细胞后炎性因子的分泌减少和炎症反应也减轻,从炎症部位分离的巨噬细胞可分泌TGF-β1。体内注射凋亡细胞后，巨噬细胞分泌TGF-β1明显增加，而注射活细胞没有影响。有趣的是，虽然巨噬细胞的吞噬对于TGF-β1分泌是重要的，但是，调理细胞（非凋亡细胞，但通过调理后产生的Fcγ受体可介导细胞吞噬）虽然也可被吞噬，但不能刺激巨噬细胞产生TGF-β1。不表达PS凋亡细胞（如Jurkat细胞、PBL-985细胞）也不能诱导TGF-β1产生。转染PS后PBL-985细胞可诱导TGF-β1,提示PS介导吞噬作用对于诱导巨噬细胞产生TGF-β1是至关重要的(110)。输血诱导移植物免疫耐受模型中，移植物内TGF-β1表达增高，用TGF-β1抗体可使移植物排斥，证明这种免疫耐受可能与移植物内高表达TGF-β1有关(111，112)。
如前所述，肝脏是体内吞噬凋亡细胞的主要器官，Kupffer细胞是肝内主要吞噬细胞。假如TGF-β1是肝内吞噬细胞介导免疫调节作用的主要分子，则Kupffer细胞应该能够分泌TGF-β1。在正常成年动物的肝脏内发现，Kupffer和LSEC细胞含有较多TGF-β1 mRNA，而TGF-β2和TGF-β3 mRNA 含量较少，而肝细胞几乎不含有TGF-βmRNA(113)。
（四） 理论模型
前面从微观角度分析讨论凋亡细胞调节免疫耐受的细胞和分子机制，但机体为何要启动凋亡细胞诱导免疫耐受这一过程呢？从传统观点来看，凋亡细胞作为自身抗原一部分应该是天然耐受，没有必要专门启动凋亡细胞诱导耐受程序。要深刻认识这一点，还需从免疫识别模型谈起。
长期以来，免疫学被“自我非我”（又称克隆选择）学说所统治，该学说最早来源于1953年Medawar进行的新生小牛皮肤移植实验，1957年至1959年Burnet完成了“自我非我”学说由假说向理论的转变。该理论要点是：
①体内存在着具有各种不同受体的免疫细胞克隆，即细胞系 。
②抗原进入机体选择具有相应受体的免疫细胞克隆，使之活化、增殖和分化，最后形成产生抗体的细胞或免疫记忆细胞；
③胚胎时期某一克隆如接触到相应抗原（包括外来及自身），即被抑制或删除，称为禁忌克隆（forbidden clone）或禁系，机体由于丧失了针对这些抗原的特异性免疫细胞克隆，而产生免疫耐受；
④禁忌克隆可以复活或突变，成为能与自身成分起反应的克隆。该理论对于免疫学和移植学曾起到一定的推动作用，如移植学中的HLA配型理论和实践即受惠于“自我非我”学说。
数十年过去之后，人们逐渐发现该理论有明显缺陷：
①首先机体作为一个整体系统，与其周围环境存在着不间断物质与信息交换，免疫系统作为其中的一个子系统也应如此，并且维持一个动态平衡。而“自我非我”学说总体上用静止观点看待事物，认为决定免疫系统对某一特定抗原产生免疫应答或免疫耐受的根本，在于胚胎或出生后一段短暂时间内免疫系统是否曾接触到该抗原，而忽视了生物有机体复杂、多样、变化和动态平衡的特点；
②难以解释很多免疫学的现象，例如：哺乳动物在青春期身体有很多变化，伴随许多新分子表达（如乳汁蛋白等），但为何不患自身免疫性乳腺疾患呢？男性精子为何可毫无阻拦地进入到HLA明显不同的女性体内而不产生排斥反应？妇女不但可以怀孕HLA抗原与母体不相同、甚至血型都不同的胎儿，但为何不发生流产？而当这些胎儿长大成人时，再给母体移植器官却发生强烈排斥反应呢？虽然胎盘可作为一个物理屏障，却无法阻挡母体和胎儿之间的细胞交流,母体血液内可发现胎儿来源的细胞并可用于产前诊断(114)。同样是细菌，为何伤寒杆菌诱发强烈免疫反应以清除细菌，而肠道内正常菌群却得以“安居乐业”，并作为身体必不可少的组成部分呢？同样是病毒，为何有些病毒诱导强烈终身免疫（如天花）而有些病毒则可在动物“毫无知觉”情况下寄生体内（如呼吸道寄生的大量病毒，乙型肝炎携带者等） ?又为何同样是蛋白，注射蛋白可以诱导强烈免疫反应，而我们每日食用大量动植物蛋白，小肠内还富含丰富淋巴细胞，但免疫系统又为何视而不见呢？曾几何时，我们坚信免疫系统有防护“新生肿瘤”的作用，认为肿瘤所表达的“新抗原”分子必将被成年动物免疫系统所识别而排斥。只有当免疫系统功能降低，防护能力缺乏时才生长肿瘤。但人们发现一些非病毒相关肿瘤（如乳腺癌、肺癌等）发病率在免疫健全和免疫缺陷病人中没有差别(115)。裸鼠（T细胞和B细胞功能缺陷）肿瘤发生率和正常小鼠没有区别。更有甚者，转基因小鼠研究表明，肿瘤不但不诱发免疫应答反应，相反诱导免疫耐受(116-118)。因此，我们认为老年人易发肿瘤并不奇怪，因为“一部老机器当然比一部新机器容易坏”，由于年纪的原因各种致病因素的作用时间长，细胞老化等都有可能使老年人容易生肿瘤。事实上，老年人其它系统如心血管系统疾病的发病率更高。我们一般把器官移植术后肿瘤发生率增加归结于术后长期免疫抑制治疗引起的全身免疫功能降低，但实际上却有可能是我们所用的环孢素A或其它免疫抑制剂的直接致瘤作用(119)；
③“自我非我”学说关键依据是新生小牛皮肤移植实验，该实验得出的重要假设是胚胎或新生动物免疫系统发育不成熟，对抗原尚无区分“自我非我”能力，此时接受的所有抗原（包括外来抗原）认为是“自我”加以耐受，而在此时期内未接触到的抗原认为是“非我”而加以排斥，但已有证据表明胚胎和新生动物的免疫系统同样具有免疫应答反应能力，能产生和成年动物一样的免疫反应。这一发现给“ 自我非我”学说以致命一击，动摇了给整个“自我非我”学说的根基(120，121)。实际上，新生动物免疫细胞和成年动物相比，也许只有数量和功能上的差异，但并非本质区别，只要给予强烈一些的刺激照样可以诱发与成年动物同样的免疫应答反应(122;123) 。
那么决定免疫系统针对某一特定抗原的免疫反应方向的根据是什么呢？鉴于单独抗原本身不能引起免疫应答反应，1970年由 Bretscher/Cohn’s 提出了抗原的双信号学说，认为能引起免疫应答的抗原有两种特性，抗原的一端提供其特异性的决定簇，而抗原的另一端通过T细胞传递的“辅助”（help）信号。这一理论说明抗原决定簇本身并不能诱导免疫应答反应，而需要另外一个“辅助”信号(124)。1974年Zinkernagel等发现了T细胞活化的MHC限制性现象，即T细胞不能识别游离的抗原，而只能识别由MHC提呈的抗原(125)。据此，1975年Lafferty和Cunningham’s修改了Bretscher和Cohn的学说，提出对T细胞的活化必须具备两个方面条件: 其一是由抗原递呈细胞表面的MHC-抗原肽复合物与T细胞表面的TCR形成的第一信号途径；其二抗原提呈细胞同时还必须提供一个辅助刺激信号以活化相应T细胞克隆，否则将不能诱导免疫应答反应，主要思想是T细胞需要共刺激信号以帮助增强抗原信号的活化能力，同时明确了辅助刺激信号来自于抗原提呈细胞。但继续研究发现，若仅仅有抗原信号而没有共刺激信号，提呈的抗原不但不能诱发免疫应答反应，相反可诱导免疫耐受。这一发现表明免疫反应的根本并非抗原本身的性质，因而对“自我非我”学说提出质疑。此后整个免疫学界和移植界都欣起了研究共刺激信号的热潮，但要彻底否定“自我非我”学说必须解释两个基本问题：共刺激信号的来源和活化方式。1994年Matzinger提出“危险理论”（danger model）引起了免疫学界和移植学界震动。该理论核心是：免疫系统并不关心其所接触的抗原是否“自我非我”，而是关心其是否受到损害（即是否存在危险信号）；若机体组织受到伤害则产生危险信号活化抗原提呈细胞，使其在提呈抗原同时提供共刺激信号，从而激活免疫系统产生免疫反应；若机体未受到伤害，则在提呈抗原同时不提供共刺激信号，而诱导免疫耐受(126)（图7）。该理论中，危险信号来源是其关键，若不能成功地找到危险信号则难以令人信服。Matzinger认为危险信号来自自身组织死亡方式：细胞凋亡没有危险信号释放，抗原提呈细胞不被活化，因而在其提呈时不伴有共刺激分子的表达，结果诱导T细胞免疫耐受；在感染、外伤、排斥反应等情况时细胞发生坏死，释放危险信号，活化抗原提呈细胞表达共刺激信号，诱导T细胞免疫应答。过去几年，许多研究者都投身到了寻找危险信号的行列中，相继发现感染、细胞坏死、细胞损伤均可诱导抗原提呈细胞成熟，使其表达共刺激信号，并发现热休克蛋白、补体、DNA和RNA等均可作为共刺激信号(127-132)。
Matzinger 危险信号理论比较成功地解释了坏死细胞为何能诱导免疫应答反应，能够解释更多免疫学现象，如移植排斥、肿瘤等，但对于凋亡细胞为何诱导免疫耐受解释似乎过于简单：即细胞凋亡时没有危险信号释放，抗原提呈时若没有危险信号则默认模式即是免疫耐受。本文前面分析表明，凋亡细胞在免疫反应过程中并非被动角色，而是通过特异性吞噬、释放抑制性淋巴因子主动地诱导了对凋亡细胞内自身分子的免疫耐受，这进一步拓展了Matzinger思想。若由于种种原因凋亡细胞过多或清除能力下降致使凋亡细胞未被及时清除，则凋亡细胞有可能发生继发性坏死，从而释放危险信号导致免疫应答反应。缺血、外伤或感染等均存在直接导致细胞坏死（或损伤）的因素，因而可以直接活化抗原提呈细胞导致免疫应答反应。据此，我们提出了以抗原提呈细胞吞噬为中心的凋亡细胞免疫调节模型（见图）。该模型与Matzinger的危险信号理论有相通之处，但不同的是强调了在体情况下凋亡细胞的主动性免疫耐受诱导作用，而在Matzinger的理论认为凋亡细胞仅仅是无“危险信号”的释放（而非主动性免疫耐受调节作用）(133) 。
图8 凋亡细胞免疫调节模型。凋亡细胞诱导免疫耐受而坏死细胞引发免疫应答反应。凋亡细胞膜表面表达特殊分子，被吞噬细胞（巨噬细胞或DC）相应受体识别，这导致凋亡细胞在其早期即被吞噬，凋亡细胞来源抗原被加工和提呈给童贞T细胞。由于凋亡细胞或吞噬细胞分泌抑制性淋巴因子，凋亡细胞抗原不但不引起免疫应答反应，相反诱导免疫耐受。另一方面，如果凋亡细胞过多，超过吞噬细胞吞噬能力，则会出现凋亡细胞聚集和继发性坏死，一些感染也可直接导致细胞坏死。这些坏死的细胞将释放“危险信号”以刺激免疫系统，因此当这些细胞碎片最终被吞噬细胞所吞噬时，其细胞上抗原必将被有效提呈，同时在共刺激信号作用下活化相应T细胞克隆，产生免疫应答反应。
七、 凋亡细胞调节免疫意义与临床应用
根据以上模型，我们可以清楚明了地解释一些免疫学基本问题。
① 在体内容易诱导免疫耐受的部位，也基本上存在大量凋亡细胞，如肠道 、胸腺、眼前房和肝脏等，这些部位凋亡细胞有助与于免疫耐受诱导。
② 成年动物妊娠对其母体来说不是一个危险信号，而且在滋养层有大量凋亡细胞，胚胎发育过程当中也伴随有大量细胞凋亡，这些凋亡细胞有助于免疫耐受诱导。同时这也解释了为何胚胎或新生动物易于诱导免疫耐受的原因（笔者认为，胚胎或新生动物仅仅是易于诱导免疫耐受，而非“自我非我”学说所认为的“胚胎接触抗原的结果一定是免疫耐受”）。
③ 在体内细胞凋亡可发生在各个组织器官，但凋亡细胞尤其是血液细胞如中性粒细胞、淋巴细胞和衰老红细胞等主要在肝脏被清除，肝脏在凋亡细胞诱导免疫耐受中扮演着重要角色。因而不难理解为何门静脉注射更容易诱导免疫耐受、肝移植更容易诱导免疫耐受等免疫学现象。
④ 在体内不同性质感染后果不同，一些病毒感染（如呼吸道病毒感染、HIV感染等）使患者抵抗力降低（白细胞降低，并易继发细菌感染），这些病毒很可能诱导了宿主细胞凋亡而抑制了免疫应答能力(134)。而一些机体不易清除而形成慢性携带的病毒（如乙型肝炎病毒等）则有可能是这些病毒诱导了局部组织或器官的细胞凋亡诱导了局部免疫耐受。一些病毒和细菌可引起强烈免疫反应，如天花病毒、伤寒杆菌等，这些病毒和细菌均可导致严重组织坏死，因而诱发强烈免疫应答反应。寄生虫之所以易在宿主体内生长，是由于它主要在细胞外生长，不引起细胞坏死（有些甚至引起凋亡），凋亡细胞在吞噬时分泌TGF-b等抑制因子抑制了局部免疫反应，易于诱导免疫耐受而促进寄生虫感染(78)。
⑤肿瘤在其生长过程中不引起细胞坏死，而且有一些肿瘤由于生长过快，部分细胞缺血引起凋亡相反可诱导局部免疫耐受，所以尽管有一些新“肿瘤标志物”表达，但并不引起免疫应答反应。这也是为何肿瘤病人一般均无觉察，只有当肿瘤生长到一定程度对周围组织产生压迫或损伤时才产生相应症状的原因。相反若肿瘤在生长和浸润过程中对组织产生了破坏，则产生了危险信号活化免疫系统产生针对肿瘤的免疫反应(135)。在清除肿瘤的同时使其细胞坏死则有可能激活免疫系统，帮助清除肿瘤。已有证据表明，将巨噬细胞与坏死肿瘤细胞共培养有助于清除肿瘤，相反若巨噬细胞与凋亡细胞共培养则促进肿瘤生长(136)。在肿瘤周围常常可以发现TGF-b表达，这可能就是肿瘤局部免疫耐受的分子基础(137-139)。
⑥如前所述，自身免疫性疾病中至少有部分机制是由于凋亡细胞未能及时清除，细胞继发坏死而释放“危险信号”激活免疫反应。
⑦移植时由于供者器官在切取和保存过程中存在缺血和缺氧导致细胞损伤，而且移植外科手术本身有大量细胞组织被切割、电灼等致组织坏死而释放“危险信号”，因而易于引起移植物排斥。如我们所熟知的补体，虽然我们已知它是攻击细胞的重要分子，但是它对移植器官的破坏却不是直接作用，而是作为危险信号活化免疫细胞，通过免疫细胞攻击移植物(140-143)。既往经验告诉我们，无血缘关系的非亲属活体肾移植即使HLA配型不如尸体移植，效果也优于尸体肾移植，侧面提示热缺血和冷缺血时间在移植物排斥反应中的重要性(144，145)。虽然我们可以在切取、保存以及手术过程中尽量减少损伤，要做到完全避免损伤是不可能的。那么我们有没有其它下调危险信号的方法呢？我们认为输注供者凋亡细胞或者在给予供者抗原的同时使用细胞凋亡诱导剂是诱导免疫耐受策略之一。已有报道若给予供者抗原的同时给予细胞凋亡促进剂如雷帕霉素(Rapamycin)则有利于免疫耐受的诱导，相反若给予环孢素A阻断细胞凋亡则妨碍免疫耐受的诱导(146-148)。笔者的课题组近年来也做了这方面的尝试，发现：（a）凋亡细胞诱导剂单独使用即可诱导大鼠心脏移植物长期存活；（b）在对受者不用任何免疫抑制剂情况下，凋亡供者脾细胞可延长大鼠心脏移植物存活，尤其引人注目的是凋亡供者脾细胞能诱导大鼠肝脏移植物长期存活（达1年以上），而不需要对受者使用任何免疫抑制剂（孙尔维等，未发表资料）。与此类似的是，骨髓移植模型中，给予凋亡细胞（不管是自体、同种异体、第三者或是异种来源）可提高骨髓移植成活率(149)。
⑧免疫耐受和免疫应答反应是由细胞因子进行精细调控的，细胞因子是细胞分泌作用于细胞之间的分子，由于这些因子作用距离短（内分泌和神经系统是长距离调节系统），因而免疫耐受和免疫应答是局部反应，这就说明了为何脚癣感染仅表现为腹股沟淋巴结的肿大，而肠道对某些正常菌群耐受并不影响其它部位的免疫应答反应。
八、 结论和今后研究策略
数十年来建立在“自我非我”学说基础之上的免疫学和移植学，认为免疫应答和免疫耐受的关键是机体内是否存在抗原特异性的免疫细胞（主要指T细胞和B细胞）克隆，因而治疗上也主要采用免疫抑制的方法。随着对免疫识别本质认识的不同，笔者认为针对不同的情况应采取不同的策略。
① 在许多情况下，免疫反应是一个局部事件，通过局部的淋巴因子传递控制信号。这有两个方面的意义，一方面免疫反应是一个非常强烈的反应（为了与感染病原体抢速度，特异性克隆在3～5天内增殖达1000，000倍），因此必定在反应初始阶段即存在局部淋巴因子高浓度，这样既可以在局部形成快速反应又不引起全身副作用；另一方面免疫反应是多种细胞与淋巴因子序贯参与。而曾经风行一时的全身应用淋巴因子免疫治疗效果不佳的原因可能是：难以在避免全身副反应情况下达到局部治疗浓度；其次淋巴因子作用复杂，往往随着免疫反应的不同时相而有不同作用，单一淋巴因子量的变化也难以撼动免疫反应的整个淋巴因子网络。如人们曾认为IL-2是T细胞增殖因子，但期望注射IL-2增强抗肿瘤效果，但未能如愿。实际上IL-2作用复杂，除了免疫反应初期担当T细胞增殖因子外，还在免疫反应过后担当T细胞诱导凋亡剂以清除过时T细胞克隆，IL-2基因敲除小鼠不但没有免疫低下，相反出现活化T细胞积聚和自身免疫性疾病(150)。FasL是公认细胞凋亡诱导分子，但在免疫反应早期，它扮演细胞增殖因子的角色(151)。因此，我们应该慎重对待应用或转染某种淋巴因子调节免疫反应的想法。
②免疫学目前的状况是知道较多，但理解甚少。现阶段仍难以找到有效调节免疫反应的手段，免疫耐受的诱导也仅仅停留在小动物实验阶段。因此全身应用免疫抑制剂仍是今后一段时间内不可或缺的治疗手段。但是应用凋亡细胞诱导免疫耐受给我们提供了一丝曙光：凋亡细胞在体内特异性地被吞噬细胞吞噬和清除，在其清除过程中不但抗原可被提呈，而且有抑制性淋巴因子的分泌，从而诱导免疫耐受。由于这是生物体在进化上保守的重要生命现象，凋亡细胞被吞噬后所引起的细胞和局部淋巴因子的变化必定是序贯和程序化的，对免疫耐受的诱导应该是效果好和副作用小。因此今后对于凋亡细胞的研究不应仅限于其凋亡机制，对其吞噬清除和调节免疫的机制需要进一步阐明，从中寻找出关键环节加以控制。在自身免疫性疾病发生机制中要注意是否存在自身凋亡细胞过量或吞噬清除功能降低情况，找出及时清除凋亡细胞方法。同时进一步研究在移植中凋亡细胞诱导免疫耐受的可能性和方法(91，152，153)。
③ 在疫苗研制、抗体制备或肿瘤防治等需要诱导强烈免疫应答反应时，应注重对不同佐剂研究。以前的佐剂主要是一些细菌代谢产物，能否寻找细胞内某种成分作为佐剂，以提供更多危险信号。在肿瘤治疗中，现有一些方法（如微波凝固治疗）可以在清除肿块的同时提高免疫反应，并且降低肿瘤的复发率、延长患者的生存时间。
④ 在病毒感染等能引起细胞凋亡的感染中，除了清除病毒的治疗外可考虑阻断细胞凋亡、吞噬或抑制性淋巴因子的分泌，以达到多提供危险信号活化免疫系统以加强清除病毒的能力。
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