【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）
发布于 2013-06-25 · 浏览 2.9 万 · IP 北京北京
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技术审评要求的提高，相信大家都深有体会，时隔多年，这次讨论的话题--有关物质检查专属性实验（强制降解试验），试从以下方面展开讨论，欢迎各位参与：
序：
仿制药的有关物质研究，主要包括以下重要内容：
①根据工艺、结构特征和降解途径对杂质谱进行分析；
②研究建立可靠的检测方法，方法的灵敏度（检测限）、专属性、定量限、线性、耐用性等应符合要求；
③对杂质检查结果进行综合分析，确定进一步工作目标和措施；
④结合指导原则对报告限度、鉴定限度、质控限度的要求，确定合理的杂质控制限度；
⑤杂质研究与其他研究工作的联系。
第一条“根据工艺、结构特征和降解途径对杂质谱进行分析”，我们这次仅作“强制降解试验”专题讨论：
1，强制降解试验：通过设计适当强度的光、湿、热、酸、碱、氧化等条件，对药物进行强制破坏。
2，目的：考察原料药或制剂对光、湿、热、酸、碱、氧化等的稳定性、敏感性，主要的降解途径及降解产物，并据此进一步验证所用分析方法的可行性、确定加速试验的放置条件及为选择合适的包装材料提供参考。
3，实验方法：
A，原料药：同法进行空白溶剂对比试验；
B，制剂：同法进行空白溶剂、原料药、空白辅料对比试验；
①参考 WHO- Stability testing：
Heat 60°C
Humidity 7 5% RH or greater
Acid 0.1N HCl
Base 0.1N NaOH
Oxidative 3% H2O2
Photolytic Metal halide, Hg Xelamp, or UV-B/fluorescent
②常规条件：以1M酸、1M碱、30%H2O2、100℃烘箱、LX4500光照及RH95%高湿过夜；
说明：强制降解条件并无硬性规定，可根据原料性质制定适宜强度，如高温破坏，可结合原料药熔点的不同，破坏至外观性状改变即可；如氧氟沙星原料药，在光照中不稳定，则光照试验可缩短至1～8h即可；如某药结构式中含有醇羟基，很容易氧化，则可缩短氧化试验时间；如苯磺酰基为较为稳定结构，则可适当加大破坏力度；如破坏过度，则可缩短破坏时间或降低浓度，如将1M改成0.1M，30%双氧水改为10%；本人习惯先采用条件②方法进行强制条件试验。
4，强制降解要求：一般降解不超过30%，以10%~20%为佳；
5，结果判断：
①分离度：要求各色谱峰分离度大于1.5；
②峰纯度：DAD检测器，根据不同品牌仪器数据要求，峰纯度指数应合格；
③物料平衡：
方法一：对未破坏与破坏后主峰峰面积进行对比，如主峰降解20%，杂质应最少能检出18%左右，即含量下降多少，有关物质应能相应检测出多少杂质，此法适用于自身对照法中供试品溶液主峰与自身对照主峰呈线性关系，且供试品溶液主峰不出现平头峰现象；
方法二：采用含量测定方法，对强制降解样品同时进行含量测定，考察主药下降含量与杂质检出量是否达到平衡；
说明：个人推荐方法二，更科学合理，其缺点在于对降解后样品进行有关物质的同时进行含量测定，溶液稳定性需要考虑，人员、仪器、时间消耗较大；
6，注意事项/案例分析：
案例-1：某药物直接称量后置容量瓶，加入酸碱氧等溶剂后进行降解，未能达到要求，此时，可以考虑将该药物配制成浓溶液形式，以液体形式放入容量瓶，再加入酸碱氧等溶剂破坏，通常情况下溶解后的药物溶液更容易达到破坏要求；
案例-2：某药物在1M酸中过夜破坏，仍达不到降解要求，将该酸破坏样品同时放入100℃烘箱甚至电炉直火破坏，直至有更多的杂质被破坏出来，这种实验设计，个人不建议，因为采取多条件下同时破坏可能能达到破坏要求，但违背了“了解药物对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性，主要的降解途径及降解产物”的目的。
案例-3：大于1%的降解杂质，目前3、6类药暂无定性要求，欧洲和英国药典原料药标准后面，大部分都附有可能产生的中间体和副产物化学结构，如有杂质对照品则可在破坏试验同时进样杂质对照，采用相对保留时间来表征各有关物质的归属情况，说明某破坏条件下能检测出起始原料/副产物/中间体，增加方法专属性说服力。
案例-4：同样降解条件下原料氧化破坏有杂质，而制剂无杂质，可看处方中是否添加了抗氧剂的原因，如焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等，必要的话，设计不含抗氧剂处方样品进行降解试验，并于申报资料中予以阐述；
案例-5：某药物氧化条件下含量下降20%，仅检测出1%的杂质，查阅文献得知该药物容易氧化，氧化产物无紫外吸收，后经柱后衍生荧光检测，证明该氧化产物为降解产物，最终物料平衡；
案例-6：怎样才算物料平衡？通常情况下，个人认为，1~3%的误差是允许的，如，当降解杂质在1~2%时，含量测定结果可能没变化，可以接受；当含量下降约5%，杂质检测量不应低于3%；当含量下降约10%，杂质检测量不应低于7%；当含量下降约20%，杂质检测量不应低于15%；
案例-7：某药物氧化中检测降解杂质约10%，含量下降约20%，物料不平衡，根据化学结构推测为氧化样品未能及时进行含量测定，导致氧化产物进行进一步降解转化成无紫外吸收的杂质，解决方案：一，将30%双氧水降低为10%，由过夜降解改为4h降解，将降解速度放慢，二，及时测定有关物质和含量，缩短降解后的供试品溶液进样时间，保证测定溶液稳定性的一致性。结果有关物质降解杂质约4%，含量下降约5%，物料平衡。
案例-8：某药物酸中降解杂质约2%，含量却偏高约20%，物料不平衡，经查看峰纯度合格，但主药色谱峰变形，如下图，推测有杂质与主药未完全分离，色谱峰变宽，峰面积增大导致，经优化色谱条件，使该杂质分离完全，并同时进行MS结构确证，确定为该物质的左旋异构体，在普通反相色谱中分离不完全，同时将原单独制定的正相左旋异构体色谱条件取消，在同一色谱条件下进行检验。
注意事项-1：通常情况下，不是所有强制条件都能达到要求，故试验中，以“1M酸、1M碱、30%H2O2、100℃烘箱、LX4500光照及RH95%高湿过夜”为最剧烈条件，如降解过度（超过30%），应减小破坏强度；杂质情况无变化或无新降解杂质说明药物在该条件下稳定，该强制条件设计已经很苛刻，不必进行更强烈破坏。
注意事项-2：每种分析方法均具有一定的局限性，必要时可采用不同原理的分析方法间的互相补充与验证，如HPLC与TLC及HPLC与CE的互相补充，反相HPLC系统与正相HPLC系统的互相补充，HPLC不同检测器结果的互相补充等.
以上仅个人意见，希望能看到更多同行的实验设计及观点。
序：
仿制药的有关物质研究，主要包括以下重要内容：
①根据工艺、结构特征和降解途径对杂质谱进行分析；
②研究建立可靠的检测方法，方法的灵敏度（检测限）、专属性、定量限、线性、耐用性等应符合要求；
③对杂质检查结果进行综合分析，确定进一步工作目标和措施；
④结合指导原则对报告限度、鉴定限度、质控限度的要求，确定合理的杂质控制限度；
⑤杂质研究与其他研究工作的联系。
第一条“根据工艺、结构特征和降解途径对杂质谱进行分析”，我们这次仅作“强制降解试验”专题讨论：
1，强制降解试验：通过设计适当强度的光、湿、热、酸、碱、氧化等条件，对药物进行强制破坏。
2，目的：考察原料药或制剂对光、湿、热、酸、碱、氧化等的稳定性、敏感性，主要的降解途径及降解产物，并据此进一步验证所用分析方法的可行性、确定加速试验的放置条件及为选择合适的包装材料提供参考。
3，实验方法：
A，原料药：同法进行空白溶剂对比试验；
B，制剂：同法进行空白溶剂、原料药、空白辅料对比试验；
①参考 WHO- Stability testing：
Heat 60°C
Humidity 7 5% RH or greater
Acid 0.1N HCl
Base 0.1N NaOH
Oxidative 3% H2O2
Photolytic Metal halide, Hg Xelamp, or UV-B/fluorescent
②常规条件：以1M酸、1M碱、30%H2O2、100℃烘箱、LX4500光照及RH95%高湿过夜；
说明：强制降解条件并无硬性规定，可根据原料性质制定适宜强度，如高温破坏，可结合原料药熔点的不同，破坏至外观性状改变即可；如氧氟沙星原料药，在光照中不稳定，则光照试验可缩短至1～8h即可；如某药结构式中含有醇羟基，很容易氧化，则可缩短氧化试验时间；如苯磺酰基为较为稳定结构，则可适当加大破坏力度；如破坏过度，则可缩短破坏时间或降低浓度，如将1M改成0.1M，30%双氧水改为10%；本人习惯先采用条件②方法进行强制条件试验。
4，强制降解要求：一般降解不超过30%，以10%~20%为佳；
5，结果判断：
①分离度：要求各色谱峰分离度大于1.5；
②峰纯度：DAD检测器，根据不同品牌仪器数据要求，峰纯度指数应合格；
③物料平衡：
方法一：对未破坏与破坏后主峰峰面积进行对比，如主峰降解20%，杂质应最少能检出18%左右，即含量下降多少，有关物质应能相应检测出多少杂质，此法适用于自身对照法中供试品溶液主峰与自身对照主峰呈线性关系，且供试品溶液主峰不出现平头峰现象；
方法二：采用含量测定方法，对强制降解样品同时进行含量测定，考察主药下降含量与杂质检出量是否达到平衡；
说明：个人推荐方法二，更科学合理，其缺点在于对降解后样品进行有关物质的同时进行含量测定，溶液稳定性需要考虑，人员、仪器、时间消耗较大；
6，注意事项/案例分析：
案例-1：某药物直接称量后置容量瓶，加入酸碱氧等溶剂后进行降解，未能达到要求，此时，可以考虑将该药物配制成浓溶液形式，以液体形式放入容量瓶，再加入酸碱氧等溶剂破坏，通常情况下溶解后的药物溶液更容易达到破坏要求；
案例-2：某药物在1M酸中过夜破坏，仍达不到降解要求，将该酸破坏样品同时放入100℃烘箱甚至电炉直火破坏，直至有更多的杂质被破坏出来，这种实验设计，个人不建议，因为采取多条件下同时破坏可能能达到破坏要求，但违背了“了解药物对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性，主要的降解途径及降解产物”的目的。
案例-3：大于1%的降解杂质，目前3、6类药暂无定性要求，欧洲和英国药典原料药标准后面，大部分都附有可能产生的中间体和副产物化学结构，如有杂质对照品则可在破坏试验同时进样杂质对照，采用相对保留时间来表征各有关物质的归属情况，说明某破坏条件下能检测出起始原料/副产物/中间体，增加方法专属性说服力。
案例-4：同样降解条件下原料氧化破坏有杂质，而制剂无杂质，可看处方中是否添加了抗氧剂的原因，如焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等，必要的话，设计不含抗氧剂处方样品进行降解试验，并于申报资料中予以阐述；
案例-5：某药物氧化条件下含量下降20%，仅检测出1%的杂质，查阅文献得知该药物容易氧化，氧化产物无紫外吸收，后经柱后衍生荧光检测，证明该氧化产物为降解产物，最终物料平衡；
案例-6：怎样才算物料平衡？通常情况下，个人认为，1~3%的误差是允许的，如，当降解杂质在1~2%时，含量测定结果可能没变化，可以接受；当含量下降约5%，杂质检测量不应低于3%；当含量下降约10%，杂质检测量不应低于7%；当含量下降约20%，杂质检测量不应低于15%；
案例-7：某药物氧化中检测降解杂质约10%，含量下降约20%，物料不平衡，根据化学结构推测为氧化样品未能及时进行含量测定，导致氧化产物进行进一步降解转化成无紫外吸收的杂质，解决方案：一，将30%双氧水降低为10%，由过夜降解改为4h降解，将降解速度放慢，二，及时测定有关物质和含量，缩短降解后的供试品溶液进样时间，保证测定溶液稳定性的一致性。结果有关物质降解杂质约4%，含量下降约5%，物料平衡。
案例-8：某药物酸中降解杂质约2%，含量却偏高约20%，物料不平衡，经查看峰纯度合格，但主药色谱峰变形，如下图，推测有杂质与主药未完全分离，色谱峰变宽，峰面积增大导致，经优化色谱条件，使该杂质分离完全，并同时进行MS结构确证，确定为该物质的左旋异构体，在普通反相色谱中分离不完全，同时将原单独制定的正相左旋异构体色谱条件取消，在同一色谱条件下进行检验。
注意事项-1：通常情况下，不是所有强制条件都能达到要求，故试验中，以“1M酸、1M碱、30%H2O2、100℃烘箱、LX4500光照及RH95%高湿过夜”为最剧烈条件，如降解过度（超过30%），应减小破坏强度；杂质情况无变化或无新降解杂质说明药物在该条件下稳定，该强制条件设计已经很苛刻，不必进行更强烈破坏。
注意事项-2：每种分析方法均具有一定的局限性，必要时可采用不同原理的分析方法间的互相补充与验证，如HPLC与TLC及HPLC与CE的互相补充，反相HPLC系统与正相HPLC系统的互相补充，HPLC不同检测器结果的互相补充等.
以上仅个人意见，希望能看到更多同行的实验设计及观点。
最后编辑于 2013-06-27 · 浏览 2.9 万
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