【求助】原代肝细胞离心及percoll分离

问题：
1、大鼠原代肝细胞分离后，利用50g低速离心（不用percoll，普通低速离心分离，水平离心机），发现离心后大概分2到3层，上层清液，下层大概又分2层。为什么这么说呢，因为下层细胞沉淀，其中最下面管底细胞沉淀较为紧密（需吹打或震动才会分散），稍上面一点的细胞就相当松散（倾倒上清的时候都可以直接倒出去，而且此处细胞层厚度相当厚）。请问，这层较为松散的细胞是不是需要保留？我镜检下发现该处细胞也是活的，但未于底层紧密层比较。

2、配制某一浓度的Percoll溶液后，使用时如何使用？是先加入Percoll溶液，再缓慢加入细胞悬液，防止晃动，离心；还是两种溶液加入离心管后颠倒混匀再离心？？今天第一次使用Percoll，使用时是颠倒混匀后100g、20min离心的，离心后发现最上层漂了一层死细胞，中间厚厚的清液，里面含有少量的活细胞及微量的死细胞，最下面一层是紧密的细胞沉淀。

3、使用Percoll时，溶液总体积大小有没有影响？我使用的指导方案是50ml离心管基本装满，但我实际操作时为减少Percoll使用量（还是蛮贵的），是使用50ml离心管、溶液体积只有二三十毫升（其中各组分按比例缩小），结果会不会有很大的影响？