【讨论】请大家看看我的免疫荧光有什么问题吗？总做不出结果

我最近在做心梗后c-kit的免疫荧光，c-kit是跨膜蛋白所以我没有破膜。会不会有影响？
步骤如下：
1.处死大鼠取心脏，置于冰袋，送去做6um冰冻切片。
2.4度丙酮固定10min，冷PBS洗10min
3.正常山羊血清封闭液室温封闭1h，不洗
4.一抗（abcam，大鼠抗大鼠）1:100,1:200 50ul，室温下作用30min后，4度过夜
5.复温30min，PBS冲洗10min
6.加二抗FITC（索来宝，羊抗大鼠）1:10 50ul，37度摇床孵育1h，PBS洗10min
7.DAPI复染5min，PBS洗10min
8，抗荧光猝灭封片剂封片，干燥1小时后镜检
有人做过c-kit的荧光吗
问题1.我看到有人取心脏之前用多聚甲醛固定，蔗糖沉底，然后冰冻切片，我直接放在冰袋中保存送到病理科切片，中间约20min。有影响没有呢？
2.有人曾直接冰冻切片没出c-kit染色结果，而做石蜡切片抗原修复后出了结果，请问石蜡切片不是更容易破坏抗原吗，为什么他做石蜡切片反而能出结果？
3.我的二抗只加了50ul，但能覆盖组织，在37度孵育会不会因为加的二抗太少而干片影响了结果
4.二抗是国产的，工作效价是1:5-10，这么高的浓度，会不会影响结果
5.另外做组织的切片我都没做无菌处理的，所有器具和试剂都没高压灭菌，会有影响吗？
结果图片我没保存
没找到c-kit和DAPI重合的染色图像。我都不知道是因为本来c-kit+细胞少到找不到还是因为我染色有问题呢