做事要认真为人不较真 小白领巧用“两分论
Wegener肉芽肿病/韦格纳肉芽肿的前世今生
现在国际权威的教科书与分类中已经找不到 Wegener肉芽肿的名词，因为Friedrich Wegener 先生是**，现CHEST及爱思维尔出版等专业书籍都把它改为坏死性肉芽肿性血管炎。网上找到蔡柏蔷教授的文章，介绍的这段历史还是比较详细。
众所周知，医学上常常以疾病发现者的姓氏来命名该疾病。医学上医学名词的变更有多种原因，大家熟知的“急性呼吸窘迫综合征(ARDS)”是由“成人呼吸窘迫综合征”改名而来的，这是医学上对ARDS发病机制和病理生理的深入理解所致，获得一致同意。还有白塞病(Bechet disease)现在正式病名是“贝赫切特病”。不过新的名词演化，医患双方都要有一个接受适应的过程，了解它的历史，也有利于在卷帙浩繁的文献中做回顾性的研究工作。
Wegener肉芽肿病（Wegener's granulomatosis，现定名为“坏死性肉芽肿性血管炎”）是以Friedrich Wegener医师（1907—1990）的姓氏命名的疾病。其特征是上呼吸道和（或）下呼吸道的坏死性肉芽肿性血管炎、肾小球肾炎和不同程度的小血管炎。抗中性粒细胞抗体（ANCA）的广泛应用，对该病的诊断产生了重要影响。抗中性粒细胞抗体（ANCA）的广泛应用，对该病的诊断产生了重要影响。核周型ANCA对该病诊断的特异性较高，敏感性稍差。确诊需要在具备相应临床表现时，组织病理学有肉芽肿性炎和（或）小血管炎的证据。
Wegener于1907年出生在德国的一个小镇，其父是一名外科医师。1927年Wegener开始在慕尼黑学习医学，1932年毕业于基尔大学（University of Kiel），并对病理学产生了兴趣。1933年他在基尔大学病理系任初级助教，次年成为全职助教，这一年Martin Staemmler成为病理学系的主任。
20世纪30年代人们对血管炎几乎一无所知，1934年Wegener为一例38岁死于尿毒症的男性病例做了尸检。患者有长期发热病史，尸检发现鞍鼻变形、鼻黏膜和软骨炎症、鼻中隔破坏，中耳、咽喉、气管亦有相似病变。组织病理学显示肉芽肿性坏死性炎症。肾脏肿大，有坏死性肾小球肾炎。后来Wegener又遇到一例以慢性鼻炎和肾功能衰竭为主要表现的病例，尸检所见与第1例类似。Wegener对这些病例进行了认真细致的检查，除外了感染性病因。1936年他在布雷斯劳（Breslau，波兰西南部城市，现名弗罗茨瓦夫）召开的德国病理学会会议上报告了上述发现。1939年Wegener最终发表了该病的全文报道。
第二次世界大战爆发后Wegener在波兰的罗兹（Lodz）省担任军队病理医师。1944年因患白喉而停止工作，一年后恢复。1945年他离开Lodz，在多支部队担任战地外科医师，后被美国军队俘虏。被释放后，他在德国西北部的港口城市Lübeck重新从事病理医师的工作。
1954年Godman和Churg发表了里程碑式的论文“Wegener's granulomatosis”，直到这时Wegener才认识到自己工作的意义。1964年Lübeck建立了一所医科大学，他在此恢复了学术生涯，其尸检讲座大受学生和医师欢迎。1967年他发表了一篇关于Wegener肉芽肿的全面综述。有意思的是，Wegener自己一直不喜欢这个以姓氏命名的疾病名称。
从大学退休后，Wegener成为私人开业的病理医师，并逐步淡出学术界。他见证了环磷酰胺用于治疗他曾描述为致命的疾病，见证了ANCA成为该病的疾病标志物。1986年，一些对血管炎感兴趣的学者重新让他出山，复出后的Wegener经常参加会议，还帮助成立了一个患者支持小组。1989年美国胸科医师协会（ACCP）授予他临床大师奖。1990年83岁的Wegener参加了在Zweibrücken举办的研讨会，发表了最后一篇论文；1990年7月因中风去世。上世纪90年代，曾有人打算为他设立纪念奖奖（Wegener Award），但后来因为传言他与**和战争犯罪有关，这一计划就被放弃了。
德国肾脏病专家Woywodt和美国风湿病专家Matteson是推动对Wegener进行深入调查的重要人物。2000年国际权威医学杂志The Lancet新开辟了一个栏目“以姓氏命名的疾病”（Eponyms），这两位专家写了一篇关于Wegener肉芽肿的文章投到该刊，但因内容涉及Wegener与**的关系，被杂志拒绝。随后这两位专家开始对Wegener的生平特别是其与**的关系进行了长达5年的调查，查阅资料来自德国、以色列、英国、波兰等国家的档案。调查报告最后于2006年发表在The Lancet和Rheumatology杂志。这些证据公布以后，引发了极大争议。
调查发现Wegener于1932年完成医学学习，当年9月成为Sturm Abteilung（即棕衫组织，brown-shirts）的一员，这是一个早期**运动的准军事冲锋队。1933年5月1日希特勒夺权，Wegener于当天加入国家社会党。Weaner的系主任和导师Staemmler与当局关系密切，在所谓种族卫生（racial hygiene）问题上著述颇丰、演讲颇多。德国侵略波兰第18天，Wegener作为军队病理医师来到Lodz，开始做军队病理医生。12月10日德国人在Lodz建立了一个犹太人区，其目的是流放犹太人，但事实上很多人被流放到了死亡集中营，剩余的人成为奴隶。Wegener是否在当地的市卫生办公室担任过病理专家，仍存在争议；该办公室每个月发布50～100例尸检报告，而当时犹太区的“居民”正遭受饥寒和疾病，据信导致约43 000人死亡。Wegener后来被美国军队俘虏。尽管他的几个同事牵扯到选择被处死者，甚至参与暴行，但他并没有。Wegener的名字曾出现在波兰内务部的战犯登记上，但他从未被起诉。
ACCP主席Rosen曾著文对ACCP的“临床大师奖”及Weaner与**的关系发表了意见和说明。文章认为，毫无争议Wegener是**党的早期成员，他在Lodz担任病理专家时，成千上万的人在犹太区死亡，他不可能不知道**意识形态造成的后果。但确实也没有证据表明他直接参与战争犯罪。不管他的动机如何，主动积极参加**活动应该受到谴责。更重要的是，没有证据表明他曾公开承认其行为或为其行为道歉。ACCP授予他临床大师奖，是在对他过去参加**的事实不知情的情况下做出的。上述历史资料公布后，ACCP的领导层给予高度重视，也对这些资料进行了调查，确认了资料的真实性。在是否撤销该奖项的问题上，虽然有不同声音，但决大多数坚持撤销。终于在CHEST2007年会上，ACCP委员会投票一致同意收回该奖。他们认为该奖项是有象征意义的，收回奖项这种行动也是有象征意义的。委员会还投票同意支持其他组织对该病重新命名的行动，如果有一个更准确、更合适的名称来代替Wegener肉芽肿，ACCP将会使用新的疾病名称。
当地物价局的. 给个参考把！多谢
AMTZLABBNykARAmP
现代人的心境是急迫的，因为欲望太多，总觉得不够。赚的钱不够，住的房子不够大，车子不够豪华，职位不够，地位不够，权力不够……结果是睡眠不够，心境不够安宁。我毫无对那些充满野心，努力追求更好，试图改变世界的每一份子的鄙夷，只是想说欲望驱动着我们前行的路上，经常停下脚步坐下想想，自己在追逐什么，是不是最终想要的。
作者】 张德才； 【导师】 沈守荣；
【作者基本信息】 中南大学， 临床医学， 2013， 博士
【摘要】 研究背景与目的：结直肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤,全球每年新发病例约120万例,死亡人数达60万。在我国,结直肠癌位居恶性肿瘤死亡率第四位。近年来,我国结直肠癌的发病和死亡呈明显上升趋势。结直肠癌的发生、发展是一个涉及多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。80%以上的结直肠癌是从腺瘤癌变而来,而从腺瘤的发生至癌变的发生、发展,主要涉及癌基因、抑癌基因、错配修复基因等三类基因的变化。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生发展中起关键作用,其失活或缺失可导致细胞去调节性生长,克隆性扩张。因此,在结直肠癌病因学研究中,有必要寻找与其发生、发展相关的抑癌基因,探讨其在疾病发生发展中的作用,进一步从分子水平阐明结直肠癌的发病机制,为疾病的早发现、早诊断和早治疗提供重要的理论基础。本课题组前期研究采用荧光差异双向电泳技术构建了不同临床分期结直肠癌蛋白质差异表达谱,发现琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)是结直肠癌发病过程中一个差异表达蛋白质分子,可能具有潜在的抑癌功能。SDH也称为线粒体复合物Ⅱ,定位于线粒体内膜,是由A、B、C、D四个亚基组成的异源四聚体,分别由相应的核基因编码。SDH是三羧酸循环和线粒体呼吸链的组成部分,其在细胞能量代谢中起到重要的作用。SDH作为一个抑癌基因,其基因缺陷或表达异常与多种疾病的发生有关,如副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾癌、胃肠道间质瘤、Leigh综合征等。前期研究中我们利用免疫组化技术检测了包含103例病例的结直肠组织芯片中SDH的表达情况,发现SDHB蛋白在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且SDHB在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。目前对SDH基因在结直肠癌发生发展中的作用及机制国内外尚未见报道。本课题在前期工作的基础上,扩大样本量检测SDHB在低分化结肠癌组织中的表达以进一步证实SDHB的表达与结肠癌分化程度的关系。为了进一步深入研究SDHB基因在结直肠癌发生发展中的作用,我们构建了SDHB过表达稳定转染细胞系以明确SDHB基因对结肠癌细胞SW620生物学行为的影响。同时研究了SDHB基因对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,我们从SDHB基因突变和启动子甲基化两个方面对SDHB在结直肠癌中表达下调的机制进行了探讨。方法：本研究在包含32个点阵的低分化结肠癌组织芯片中应用免疫组化技术检测了SDHB蛋白的表达。而后采用真核表达载体pIRESneo3构建了SDHB基因稳定表达载体pIRES-SDHB,利用脂质体转染的方法将其导入SW620细胞,建立了SDHB稳定转染结肠癌细胞系。通过细胞生长曲线、平板集落形成、裸鼠移植瘤形成试验等明确SDHB对结肠癌细胞生长与增殖的作用。通过流式细胞仪检测SDHB对SW620细胞周期的影响,同时采用Western blot及免疫细胞化学法分别检测细胞周期相关分子cyclin D1和PCNA的表达。通过构建人全基因组表达谱芯片探究了SDHB基因过表达对SW620细胞基因表达谱的影响。此外,提取了40对结直肠癌及配对的癌旁正常结直肠粘膜组织gDNA,一方面采用PCR扩增了SDHB基因各外显子片段,产物纯化后进行双向测序检测各外显子突变情况；另一方面将gDNA经亚硫酸氢盐修饰后,采用甲基化特异性PCR检测SDHB基因启动子甲基化状态。结果：(1) SDHB在结直肠癌组织中的表达①免疫组织化学检测SDHB蛋白在结直肠癌组织芯片中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织的表达较正常结直肠粘膜明显下调,且其在低分化结直肠癌组织中表达较中、高分化明显减弱。②Western blot检测SDHB蛋白在结直肠癌组织中的表达,发现SDHB在结直肠癌组织中表达正常粘膜组织明显减弱。(2) SDHB基因转染对结肠癌SW620细胞生物学功能的影响①细胞生长曲线显示转染SDHB基因显著抑制了SW620细胞的生长。②平板集落形成试验显示转染SDHB基因显著抑制SW620细胞的集落形成能力。③裸鼠移植瘤形成实验表明SDHB抑制结肠癌SW620细胞致瘤性。④流式细胞仪检测发现稳定转染SDHB基因导致SW620细胞周期发生G1-S期阻滞。⑤Western blot及免疫细胞化学法检测发现SDHB下调SW620细胞中cyclin D1及PCNA的表达。(3) SDHB对结肠癌细胞基因表达谱的影响①采用Illumina公司的人全基因组表达谱芯片(Human HT-12v4)共筛选出受SDHB基因调控结肠癌SW620细胞中差异表达的基因共1653个,其中上调基因1382个,下调基因271个。②采用real-time PCR验证了部分差异表达基因,结果与芯片检测结果一致,说明芯片数据可靠。③GO分析发现差异表达基因主要参与细胞周期及其调控、细胞增殖调控、转录调控、细胞信号传导等过程。④KEGG数据库分析发现差异表达基因主要参与p53、MAPK、 Toll样受体、ErbB、Jak-STAT、T细胞受体、Notch、Wnt、TGF-β、 VEGF、细胞因子相互作用等信号传导途径。(4) SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制①PCR扩增SDHB基因各外显子片段,测序后发现在40例结直肠癌和与配对的正常结直肠粘膜组织标本中SDHB基因第一外显子第18个碱基处存在一个SNP位点,碱基由C颠换成A,致第6位密码子由GCC变为GCA,两个密码子均编码丙氨酸,为一同义突变；未发现致病性突变。结果提示SDHB基因外显子突变可能不是单纯性结直肠癌的致病原因。②MSP法未能在上述40对组织中检测出SDHB基因启动子区CpG岛甲基化,推测SDHB在结肠癌组织中表达下调可能不是由启动子区甲基化引起的。结论：(1) SDHB在结直肠癌组织中表达下调,且表达水平与结直肠癌组织分化程度相关,在低分化癌组织中表达较中、高分化癌组织明显减弱。(2)SDHB可抑制体外SW620细胞的生长与增殖,诱导细胞G1-S期阻滞；抑制SW620细胞裸鼠皮下移植瘤的形成。(3) SDHB基因外显子点突变和启动子区甲基化可能不是SDHB在结直肠癌组织中表达下调的机制。 更多还原
【关键词】 SDHB； 结直肠癌； 细胞增殖； 基因突变； 甲基化；
【文内图片】
【基金】 国家自然科学;
SOX9与NM23基因在前列腺癌中表达的研究
[img]file:///C:/Users/caozhang/AppData/Local/Temp/art851B.tmp[/img]检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要>1%的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应用西妥昔单抗的指征。
的：通过对成人肝癌、肺癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌5种耐药基因蛋白的检测，了解常见恶性肿瘤组织耐药基因表达的一般规律和特点。方法：应用SP免疫组织化学法检测120例成人常见肿瘤标本P-gp、MRP、LRP、GST-π、Topo—Ⅱ的表达。结果：1．在6种常见肿瘤中P-gp、MRP、LRP、GST-π相对高表达，而Topo-Ⅱ相对低表达。2．肝癌的5种耐药基因蛋白表达均偏高。3．2种和2种以上耐药基因的共表达率达95．83％，其中5种耐药基因共表达率达21．67％。结论：P-gp、MRP、LRP、GST-π、Topo—Ⅱ均不同程度的参与了肿瘤耐药机制，临床上可作为指导用药的综合指标，实现个体化化疗。
近日，宁夏医科大学研究人员发表论文，旨在探讨多药耐药基因（MDR1）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP）及肺耐药蛋白（LRP）mRNA在乳腺癌组织中的表达及其相互关系，分析它们与乳腺癌临床病理特征的关系。研究指出，乳腺癌组织中存在耐药基因MDR1、BCRP和LRP的表达，单基因和多基因协同作用，以多基因共表达为主；检测MDR1和BCRP基因表达水平可辅助临床判断乳腺癌患者的预后。该文发表在2012年第01期《西安交通大学学报（医学版）》杂志上。
采用RT-PCR方法检测2007年1月至2007年12月在宁夏医科大学附属医院手术切除的42例乳腺癌组织、42例癌旁组织及50例乳腺良性病变中MDR1、BCRP和LRP mRNA的表达。
乳腺癌组织中MDR1、BCRP、LRP mRNA的阳性表达率分别为40.47%、38.09%及61.90%，与癌旁组织及乳腺良性病变组织相比阳性表达率均有统计学差异（P<0.05）。MDR1mRNA表达与绝经状况呈完全正相关（r=0.398，P<0.01），与腋窝淋巴结状况呈完全正相关（r=0.398，P<0.01）；BCRP mRNA表达与腋窝淋巴结状况呈正相关（r=0.355，P<0.05）；LRP mRNA表达与绝经状况、年龄、腋窝淋巴结状况及肿瘤大小之间均无相关性（P>0.05）；MDR1mRNA和BCRP mRNA表达呈正相关（r=0.652，P<0.01），LRP mRNA与MDR1mRNA表达无相关性（r=0.147，P>0.05）；LRP mRNA和BCRP mRNA表达无相关性（r=0.111，P>0.05）。2个耐药基因共表达率为47.61%，2种或3种耐药基因共表达率为61.89%MDR是大肠癌化疗的一个主要障碍，我们必须采用各种对Pgp, mRP等进行检测，在临床及基础研究中关系到肿瘤治疗的成败，可以预测肿瘤耐药的产生，又可估计肿瘤的生物学特性，从而衡量其预后的指标. vitols et al［15］发现大肠癌的LDL受体基因表达通常高于正常结肠粘膜，而HMG-COA还原酶的基因表达在二组织中是相似的.应用一种敏感的试验方法，发现大肠癌MDR1 mRNA水平低于正常结肠组织.实验表明，同一类型肿瘤分化程度不同，其MDR1的表达量也不相同，分化好的肿瘤MDR1表达量明显高于分化差或分化中等的肿瘤，对化疗不敏感相一致.大肠癌组织MDR1基因低水平表达提示在肿瘤组织中MDR不会被Pgp介导药运送引起.早期大肠癌标本，MRP mRNA表达是由RT-PCR检测，药物灵敏的T耐药细胞作为各自的阴阳性控制而被应用的. filipit et al研究中，88%大肠癌可以表达MRP mRNA，13例大肠癌患者是阴性的MRP mRNA，并且保持阴性到RT-PCR由30～50循环时.。
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其多药耐药的发生是多因素、多阶段、多步骤共同作用的结果，针对其多药耐药逆转的研究对于提高患者的远期疗效极其重要。目前针对其多药耐药逆转机制的研究主要有针对P-糖蛋白的逆转、基因治疗、中医中药治疗等。在上述领域的研究已经取得了一定的进展，如何进一步深入研究大肠癌多药耐药的发生、发展机制，并实现多药耐药的逆转，将有助于预测和改善化疗疗效、提高消化道恶性肿瘤的综合疗效，并最终克服多药耐药这一难题。 【关键词】 结直肠肿瘤·化学治疗·抗药性，多药·逆转
在西方国家大肠癌病死率仅次于肺癌和乳腺癌，居恶性肿瘤死亡的第3位[1]，在我国占全国恶性肿瘤死因的第5位，而且发病率呈逐年升高趋势[2]。大肠癌虽然以手术治疗为主，但对于晚期及术后复发患者，化疗则是主要的治疗手段。但目前化疗疗效并不理想，多药耐药(multidrug resistance，MDR)的产生，特别是大肠癌细胞的MDR原发性高表达及继发性高表达，是大肠癌化疗疗效明显降低的主要原因之一。MDR的特点是一旦对某种化疗药物产生耐药，则对结构、细胞作用靶点和作用机制均不同的抗癌药物都会产生交叉、广谱耐药现象[3]。现在研究发现，蛋白激酶C(protein kinases C，PKC)活性的增强在MDR发生中起着关键作用，PKC可能通过MDR1基因和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)发生作用[4]。与此同时大肠癌MDR呈现多种机制，还可能同时存在谷胱甘肽-S转移酶(GST)、拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)/MDR相关蛋白基因(MDR-associated protein gene，MRP)等机制，因此如何逆转MDR成为提高大肠癌远期疗效的关键。将近年来大肠癌MDR方面的逆转研究进展综述如下。
1 针对P-gp的逆转
P-gp是由1 280个氨基酸构成的跨膜蛋白，通过激活ATP泵，阻碍药物向细胞内被动扩散，将细胞内诸如阿霉素、长春新碱等细胞毒药物向膜外主动转运，降低细胞内药物浓度，从而产生MDR作用。编码P-gp的基因为MDR1，人类MDR1基因表达与MDR表型有关。体外研究表明，MDR1基因与P-gp表达水平越高，MDR细胞内药物浓度越低，则耐药性越强[5]。目前对阻断此机制的逆转药研究较多，主要有以下几种。
1.1 钙拮抗剂
钙拮抗剂可竞争性与P-gp结合，通过充当耐药细胞外排泵的竞争性底物以增加细胞内药物的积聚量来实现逆转作用[6-8]、钙拮抗剂的拮抗活性与其MDR逆转作用无关，而与心血管系统毒性有关，后者严重妨碍其临床应用。早在20世纪80年代末，人们就发现肿瘤细胞内钙调素(calmodulin，CaM)含量高于正常细胞，钙调素拮抗剂有潜在的DNA损伤和细胞毒作用[9]。Lakshmikuttyamma等[10]用免疫组织化学和Western blot法发现45例直肠癌患者钙调磷酸酶(calcineurin，CaN，一种CaM依赖的蛋白磷酸化酶)的表达活性明显高于正常人。最近Kahl和Means[11]发现大部分CaM拮抗剂以细胞内CaM/CaM激酶(CaM Kinases，CaMK)和CaN等为靶标可以对肿瘤细胞的周期产生抑制效应。Schneider等[12]用免疫抑制剂类CaM拮抗剂环孢霉素(cyclosporine，CsA)在AR42J(一种胰腺癌细胞系)中通过抑制细胞周期素CyclinD1的启动子与转录因子的结合而达到抑制肿瘤细胞的增殖作用。Rodriguez-Mora等[13]在人乳腺癌细胞系MCF-7中导入CaMK的抑制剂NK-93或者特异性的RNA干扰片断(siRNA)后发现通过抑制CyclinD1合成和减弱pRb分子的磷酸化达到对细胞G0/G1期阻滞作用。
1.2 CsA类
在众多的逆转剂中CsA、三苯氧胺(tamoxifen，TAM)对P-gp介导的MDR有较好的疗效，二者同时应用可提高逆转效果，且毒副作用并无重叠[14]。研究表明，MRP为一种ATP依赖的跨膜蛋白，在ATP水解提供能量下可主动将细胞内药物泵出，降低细胞内药物浓度，从而产生耐药性[15]。作为逆转剂的CsA使阿霉素逾越了耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效，其作用机制是： CsA可与抗肿瘤药物竞争P-gp结合位点，抑制其跨膜转运泵作用，提高细胞内药物浓度从而逆转耐药性[16]。SDZ PSC 833(3’-酮基去甲基苏氨酸-1-缬氨酸-2-CsA，PSC 833)是环状十一肽的非免疫抑制剂[17]，属CsA类药物，是在CsA的基础上发展起来的第2代耐药逆转剂，具有逆转耐药作用强，毒性作用少的优点[18-19]。
1.3 雌激素拮抗剂
研究表明，雌激素受体(estrogen recept，ER)-β是类固醇激素受体基因超家族成员之一[20]， 在肿瘤的发生发展中ER-β表达缺失，通常被认为是一种肿瘤抑制基因[21]。有报道显示男性大肠癌的发病率和病死率是女性的1.5倍，而绝经后的妇女用雌激素替代疗法可降低大肠癌发病率[22]。最近有研究表明，大肠癌组织中ER-β表达降低是大肠癌发生的关键性分子事件[23]。大量研究报道抗雌激素药TAM可与抗肿瘤药物竞争P-gp上结合位点，使肿瘤细胞无法将药物泵出细胞外，从而增加细胞内药物浓度，达到恢复抗肿瘤药物敏感性的目的[9]。但由于大剂量TAM毒副作用较大，其临床应用受限。托瑞米芬(toremifene, TOR)是由芬兰Famos研究组于1979年研制开发的新一代抗雌激素抗肿瘤药物，是非甾体类三苯乙烯的衍生物，相对分子质量为598，分子式为C26H28NOCLC6H8O7。TOR的抗肿瘤作用机制与TAM相似，可竞争性地与乳腺癌细胞质内的ER结合，形成复合物，进入细胞核内调节mRNA和蛋白质合成，阻止癌细胞的增殖、分化，诱导具有肿瘤抑制作用的生长因子的表达和调节基因诱导的凋亡[24]。
2 基因治疗
基因治疗对肿瘤细胞MDR产生逆转的根本原因是某些基因表达不协调，导致某些与MDR相关的蛋白质和酶上调或下降，从而产生耐药[25]。在基因水平逆转MDR将是解决问题的关键。目前此方面的研究主要集中在MDR1及某些癌相关基因方面。随着基因分子生物学的发展，反义核酸技术、核酶技术、RNA干涉技术及反义RNA技术给耐药逆转提供了新的高效特异性的方法，相比传统的MDR逆转方法有较多优势[26]。
2.1 核酶
核酶是一类具有催化活性的小分子RNA，能特异地与靶RNA分子特定位点结合，进行切割，阻断目的基因的表达，因此，只要明确某一基因的结构，就能设计合成出特异性切割其mRNA的核酶，阻断该基因的表达[27-30]。Wiechen等[31]设计针对c-erbB-2 mRNA 631位点进行切割的锤头状核酶，重组人腺病毒载体后能显著抑制宫颈癌细胞系中c-erbB-2的表达。Suzuki等[32]将重组人抗her-2/neu的锤头状核酶的腺病毒注射到用乳腺癌细胞系BT-474建立的裸鼠动物模型中，肿瘤的抑制率达到20%。陈瑶和陈誉华[33]将特异性裂解GRP94 mRNA翻译起始区的核酶，用脂质体介导的转染方法导入培养的CCL229细胞中，发现细胞生长率显著降低。
2.2 反义寡核苷酸
反义寡核苷酸基因治疗是将反义寡核苷酸片段通过与适宜载体相连接后转染人细胞。反义寡核苷酸进入细胞后通过碱基互补的原则与靶mRNA 结合，形成DNA-RNA 杂交体，从而启动细胞内RNA酶(如RNase H 等)，迅速将mRNA降解[34-35]，使mRNA 的翻译功能减弱或消失，进而不能产生有效的作用蛋白;若设计好的反义寡核苷酸片段直接与mRNA翻译起始位点的碱基形成互补，则还能直接阻断mRNA 的翻译，由此来抑制靶基因的表达[36]。李玲等[37]利用MDR1和MRP mRNA翻译起始区的反义寡脱氧核苷酸，经硫代化修饰和脂质体包裹后转染高表达MDR1和MRP的耐药细胞SGC7901/ADM(阿霉素，adriamycin)，SGC7901/ADM对卡铂、紫杉醇等化疗药物的敏感性显著提高。罗华友等[38]的实验结果也证实联合抑制MDR1和MRP基因能更有效地逆转肝癌耐药细胞的耐药表型，癌细胞对ADM和柔红霉素的敏感性分别提高了47.8倍和21.6倍。
2.3 RNA干涉(RNA interference，RNAi)
RNAi是指由短双链RNA诱导的同源RNA降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表现型缺失的现象。Elbashir等[39]在哺乳动物细胞中用siRNA诱导产生了特异性的RNAi，RNAi技术迅速扩展到哺乳动物领域，可以在细胞内形成蛋白复合物，结合并裂解特定的靶mRNA，从而抑制蛋白质的表达[40]。袁保梅和李国栋[41]根据MDR1的基因序列，设计并体外转录合成2条siRNA，用脂质体转染将其导入人胃癌MDR BGC-823细胞内。结果发现BGC-823细胞MDR1 mRNA和P-gp表达均显著降低，细胞内Rh123稳态积累量均明显增高;sh-MDR1-特异性siRNA可抑制BGC-823细胞MDR1表达。夏忠胜和朱兆华[42]分别构建含编码#4029 MDR1 siRNA和#4123 MDR1 siRNA的质粒载体，并转染COLO/320DM结肠癌MDR细胞，发现稳定转染含编码MDR1 siRNA的质粒载体能稳定逆转结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的MDR。
2.4 反义RNA
反义RNA是指能够通过碱基互补与靶RNA(主要是mRNA)特异性结合，抑制靶RNA的功能，从而控制其表达的一类小分子转录物。由于能够选择性地封闭靶基因表达，所以可针对性地选择在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子和(或)受体以及部分关键酶，通过反义RNA技术特异性进行封闭结合，从而达到治疗目的。陈刚和李世拥[43]应用基因克隆技术，将MDR1反义RNA转染入对氟尿嘧啶(5-FU)耐药直肠癌细胞(8348R)中，封闭正义MDR1的转录和表达，联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R。结果发现，转染含MDR1反义RNA基因的真核表达载体的质粒后，8348R细胞在5-FU作用下较转染前活性明显下降，转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞，细胞凋亡比例显著升高;草酸铂将PC-MDR1质粒对直肠癌细胞的转染效率提高18倍，IC50剂量草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA可大大提高对8348R细胞的杀伤效率，总体杀伤效率可达到75%。
3 酶抑制
3.1 抑制谷胱甘肽(Glutathione，GSH)合成酶
GST系统是一组多功能药物代谢酶，与细胞内解毒密切相关，许多抗癌药物都是其催化的底物。不少化疗药物因GSH/GST启动细胞内解毒机制而失活[44]。丁硫氨酸亚砜亚胺(buthionine sulfoximine，BSO)为一种人工合成的氨基酸类似物，是GSH合成酶γ-谷氨酰半胱氨基合成酶的抑制剂。人体对许多化疗药如ADM、顺铂、长春新碱、环磷酰胺等都可因GSH水平增高而产生耐药，BSO通过抑制GSH的合成而逆转耐药。研究证实大肠癌MDR细胞系中的GSH/GST较相应敏感细胞系高，这些酶活性的增加与大肠癌MDR有关，GSH生物合成抑制剂buthiominet、sulfiximine可逆转MDR表型人大肠癌细胞株LS174/MDR对顺铂的耐药。Gupta等[47]用BSO处理大肠癌MDR细胞系LS180，AD150可降低细胞内GSH的含量及GSTpi活性，恢复对化疗药物的敏感性，且发现与维拉帕米合用可获得叠加作用而非协同作用。
3.2 抑制PKC
近年来有研究表明，MDR的产生总是伴随着PKC活性或含量的改变[46]，也有一些实验表明PKC可调节P-gp的活性和(或)表达;体外研究证实PKC的活化可导致MDR1基因的表达和P-gp的磷酸化，减少药物的蓄积[47]。这些研究均提示，PKC可能起到调控MDR的作用。马强和张振书[48]利用PKC激动剂佛波脂(phorbol myristate acetate，PMA)和抑制剂十字孢碱(staurosporine，SP)调节PKC，发现加入PMA后，大肠癌耐药株LoVo/Adr细胞内ADR含量明显减少;加入SP后，LoVo/Adr细胞内ADR含量明显升高。
4 中药
同化学和生物的耐药逆转剂相比，中药逆转剂低毒、高效，越来越受到国内外学者的广泛关注。同时，中药新剂型的开发亦使中药的疗效和应用范围得以扩大。中药抗肿瘤作用的机制：1)通过对肿瘤细胞周期的抑制作用和(或)对肿瘤细胞凋亡的诱导，减缓肿瘤细胞的增殖，或导致肿瘤细胞的死亡，从而起到抑制肿瘤增长的作用;2)通过对免疫系统的调节作用提高机体免疫力，保护正常细胞，延长带瘤生存期;3)中药与化疗药合用，可明显提高化疗药物的敏感性，达到有效杀伤肿瘤细胞的目的[49]。目前很多中药单体已经证实有抗肿瘤和逆转肿瘤MDR的功效，如苦参、柴胡、川芎嗪、雄黄、茶多酚、汉防己(粉防己)等[50]，但由于中药本身成分复杂，中药单体试验时仅采用单一成分或部分提取物，因此不能很好地反映中药的具体疗效以及辨证。所以学者将眼光投向可以多靶点、多途径作用的复方制剂。陈育忠等[51]将扶正固本方(黄芪、党参等)加水煎煮成浓缩液，用于对大肠癌耐药基因MDR-1 mRNA表达影响的体内实验研究，提示扶正固本方能降低大肠癌组织中的MDR-1 mRNA阳性表达，对大肠癌化疗耐药基因具有一定的逆转作用。目前大多数的研究多为体外试验，而许多试验结果还需动物实验及临床研究验证，所用中药的逆转剂量，还需结合毒理试验研究结果进行调整。需结合临床资料，大范围地筛选中药逆转剂，尤其是复方中药逆转剂，对提高化疗效果、延长癌症患者的生存期和生存质量，具有深远意义。
5 结语
综上所述，虽然肿瘤耐药的研究已取得了长足进步，但恶性肿瘤的发病机制非常复杂，要达到真正的治愈还需要一个漫长的过程。高效低毒逆转剂的出现以及大量的体外逆转实验为深入进行有效治疗肿瘤MDR的临床逆转试验作了准备。因此，努力寻找高效低毒且能用于临床的逆转剂或者开发对MDR细胞无耐药性的新型抗癌药物如肿瘤血管生成抑制剂、基因工程药物等，可以为肿瘤的治疗带来新的希望。相信随着科学研究的不断深入和大量的临床和基础实验的支持，肿瘤耐药的问题最终会得到解决。
【参考文献】
[1] Houlston RS. What could we do now: molecular pathology of colorectal cancer[J]. J Clin Pathol Mol, 2001,54(4):206-221.
[2] LabinacaR, Mosconi S, Carassino MC. New strategies in colon cancer adjuvant therapy[J]. Annals of Oncology, 2006,17(7):51-54.
[3] Biedler JL. Genetic aspects of multidrug resistance[J]. Cancer, 1992,70(6):1799-1809.
[4] 沈历宗.大肠癌多药耐药性研究进展[J].国外医学外科学分册，1998，25(4)：218-222.
[5] Qzwls RF. Clinical reversal of drug resistance[J]. Curr Probl Cancer, 1995,19(2):93.
[6] 赵行远，夏连生，吴建平，等.MDRⅠ产物P-gp在结肠肿瘤中表达的意义[J]. 世界华人消化杂志，1999，7(11)：991.
[7] Moins N, Checillard S, Maublant J, et al. Effect of MDR reversing agent combinations on the 3Hdaunomycin accumulation in drug sensitive and drug-resistant human cancer cells[J]. Anticancer Res, 2000,20(4):2617-2623.
[8] Dale IL, Tuffley H, Stewart AJ, et al. Reversal of P-glycoprotein mediated multidrug resistance by XR9051, a novel diketopiperazine derjvative[J]. Br J Cancer, 1998,78(7):885-892.
[9]任娟.多药耐药性逆转问题研究进展[J]. 国外医学肿瘤学分册，1997，24(6)：325-327
[10] Lakshmikuttyamma A, Selvakumar P, Kanthan R, et al. Increased expression of calcineruin in human colorectal adenocarcinomas[J]. J Cell Biohem, 2005,95(4):731-739.
[11] Kahl CR, Means AR. Regulation of cell cycle progression by Calcium/Calmidulin-dependent pathwaya[J]. Endocrine Reviews, 2003,24(6):709-763.
[12] Schneider G, Oswald F, Wahl C, et al. Cyclosporine inhibits growth through the activating tranacription factor/CAMp-responsive element-binding protein site in the cyclin D1 promoter[J]. J Biol Chem, 2002,277(46):43599-43607.
[13] Rodriguez-Mora OG, LaHar MM, McCubery JA, et al. Calcium/calmodulin-dependent kinase Ⅰ and Calcium/calmodulin-dependent kinase kinase participate in the control of cell cycle progression in MCF-7 human breast cancer cells[J]. Cancer Res, 2005,65(12):5408-5412.
[14] 侯梅，李晓庆，任丽，等.非霍奇金淋巴瘤MDR逆转的临床研究[J]. 中国肿瘤临床，2002，27(3)：204-206.
[15] Ros JE, Roskams TA, Genandy M, et al. ATP binding cassette transporter gene expression in rat liverprogenitor cells[J]. Gut, 2003,52(7):1060-1067.
[16] Loor F, Tiberghien F, Wenandy T, et al. Cyclosporins: structure-activity relationships for the inhibition of the human MDR1 pglycoprotein ABC transporter[J]. J Med Chem, 2002,45(21): 4598-4612.
[17] Jean LM, Herve G, Muriel BH, et al. The multidrug resistance modulator SDZ-PSC-833 potentiates the photodynamic activity of chlorine6 independently of pglycoprotein in multidrug resistant human breast adenocarcinoma cells[J]. Int J Oncology, 2003,22(12)：733-739.
[18] Sonneveld P, Burnett A, Vossebeld P, et al. Dosefinding study of valspodar(PSC 833)with daunorubicin and cytarabine to reverse multidrug resistance in elderly patients with previously untreated acute myeloidleukemia[J]. Hemato1 J, 2000,1(6):411-421.
[19] Bates S, Kang M, Meadows B, et al. A Phase I study of infusional vinblastinein combination with the P-glycoprotein antagonist PSC 833(valspodar)[J]. Cancer, 2001,92(1):1577-1590.
[20] Green S, Walter P, Kumar V, et al. Human oestrogen receptor cDNA：sequence，expression and homology to v-erb-A [J]. Nature, 1986,320(6058):134-139.
[21] Foley EF, Jazaeri AA, Shupnik MA, et al. Selective loss of estrogen receptor beta in malignant human colon[J]. Cancer Res, 2000,60(2):245-248.
[22] Campbell-Thompson M, Lynch U, Bhardwaj B. Expression of estrogen receptor(ER) subtypes and ER beta isoforms in colon cancer[J]. Cancer Res, 2001,61(2):632-640.
[23] 杜叶平.AP-α对大肠癌细胞侵袭生长及ER-β表达的影响[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(4)：358-363.
[24] 王红霞，张凤春，楼丽广，等.托瑞米芬和他莫昔芬对MCF7/ADRMDR的逆转作用[J]. 现代肿瘤医学，2007，15(9)：1216-1221.
【作者】 伍信阳；
【导师】 钟惟德；
【作者基本信息】 南方医科大学， 泌尿外科（专业学位）， 2013， 博士
【摘要】 研究背景和目的：前列腺癌(PCa)和前列腺增生(BPH)是泌尿外科常见的老年男性疾病,我国13.6%的老年男性患前列腺增生症；在西方国家,前列腺癌死亡人数仅次于第一位的肺癌。当前临床诊断中主要使用前列腺特异抗原(PSA)作为前列腺癌和前列腺增生的主要鉴别诊断手段,用Gleason评分来进行前列腺癌病理分级,用肿瘤恶性程度进行前列腺癌细胞恶性分级,用TNM分期进行前列腺癌临床分期。然而由于PSA并非前列腺癌细胞所特有,前列腺增生、前列腺炎,甚至乳腺癌等多种疾病亦会引起血浆中PSA升高。当PSA在4～10ng/ml时,难以区分PCa和BPH。而进行Gleason评分时以及肿瘤细胞的恶性程度受到病理医生的主观看法和经验的影响,也不可能对前列腺癌的恶性程度进行客观,准确的判定。因此临床有必要寻找比PSA更可靠的诊断指标,比Gleason评分及肿瘤恶性程度分级更客观的病理分级指标。近年来,SOX家族日益被人们所重视。其中的SOX9基因在前列腺组织中特异性表达。雄激素通过激活雄激素受体(AR),一方面引发级联反应,导致前列腺癌的形成。另一方面,SOX9基因可以促进前列腺癌细胞株中肿瘤细胞的变异和分化,激活基因表达SOX9分子,使SOX9表达量也在前列腺癌组织中上调表达。提示检测前列腺组织中SOX9基因的表达值可以有助于前列腺癌的早期诊断和恶性程度的评估。NM23基因是一种肿瘤定位的基因,该基因在肿瘤的转移过程中起着负性调控作用。它通过调节细胞的增生、分化、凋亡以及与细胞间的相互作用在许多生理和病理过程中发挥重要的调控作用。实时荧光定量PCR技术(fluorescence quantitative realtime polymerase chain reaction, FQ-RT-PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团或染料,利用荧光信号的变化实时监测PCR反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量原理是PCR反应时发射的荧光信号达到检测域值时的循环数(Cycle threshold, Ct),即Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。实时荧光定量RT-PCR在反转录反应后,进行实时荧光定量PCR反应,反应结果与标准曲线对照,可获得样品的起始模板量。本论文利用实时荧光定量PCR对良性前列腺增生和前列腺癌的组织中SOX9和NM23基因表达量进行定量检测。结合临床中良性前列腺增生的病理诊断和前列腺癌的Gleason评分,肿瘤恶性程度分级以及前列腺癌的临床分期,探讨SOX9和NM23基因在前列腺癌的诊断和病理分级中的意义,对肿瘤的无进展生存期的指导作用,进一步认识SOX9和NM23基因的生物行为学特征。并探讨其数值对前列腺癌各项指标的临床指导意义。材料和方法：收集广州市第一人民医院和广州医学院第二附属医院泌尿外科2009年12月至2012年12月收治的100例前列腺癌病人和80前列腺良性增生病人的临床开放手术,TURP(经尿道前列腺切除术)切下的组织、穿刺活检组织。正常前列腺组织由行膀胱癌根治术后标本获得。取得样本后,马上放入液氮瓶中速冻收集保存。其中PCa患者平均年龄73.5岁；BPH患者平均年龄68.3岁；正常前列腺3例,平均年龄58岁。并记录石蜡切片观测样本的病理恶性程度分级,Gleason评分,记录病例的临床分期和肿瘤的无进展生存期。患者的随访终点为：PSA连续两次随访再次升高,以第一次升高的时间为随访终点；或者核素骨扫描提示骨转移；或者经直肠超声、CT、MR等影像学检查提示前列腺癌局部进展或死亡。随访最后截止日期：2012年12月31日。运用实时荧光定量PCR测定标本中SOX9和NM23基因的表达量比较良性前列腺增生和前列腺癌SOX9和NM23基因表达值：(1)以临床样本提取组织样本。(2)应用Takara Taq HS试剂。(3)使用仪器为荧光定量PCR仪RotorGene2000(Corbett公司),荧光定量PCR分析软件用Rotor-gene v5。(4)提取mRNA。(5)从NCBI的gene bank中检索SOX9和NM23及β-actin基因的uniGene资料,从中获得各基因的Normal mRNA序列及相关uniSTS。用VectorNT6.0软件(Informax)定位相关uniSTS扩增片段在Normal mRNA中的位置,选择长度在100-300bp,且位置近mRNA3’端的uniSTS序列。最后再经NCBI网站的Blast软件分析和e-PCR软件确认该片段的特异性,剔除特异性较差和e-PCR结果中有重复的uniSTS引物。根据TMPRSS2和KLK11基因的mRNA序列及相关UniSTS序列,并考虑杂交和反转录标记的要求,以及ePCR结果,分析筛选到具有较好的特异性的序列。制作相应的SOX9和NM23探针序列和其相应的UniSTS引物序列。(6)对RNA样本进行实时荧光定量PCR。(7)制作标准曲线。(8)运用相对定量方法对数据进行处理。统计学处理：良性前列腺增生症和前列腺癌的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本t检验。将肿瘤恶性程度分为G1-G2以及G3两组,Gleason评分分为大于6以及小于等于6组,临床病理分期分为Ⅰ-Ⅱ组以及Ⅲ-Ⅳ组。对其肿瘤组织中的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本的t检验。对肿瘤恶性程度(G1-G2和G3),Gleason评分(小于等于6和大于等于6),肿瘤的临床分期(Ⅰ-Ⅱ和Ⅲ-Ⅳ)分组不同的无进展生存期差异,进行log-rank检验,并分别采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线；多因素分析采用Cox比例风险回归模型进行分析。将单因素分析中有统计学意义的临床病理因素：Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值纳入Cox比例风险回归模型进行综合分析,变量筛选采用逐步向前回归法,以P≤0.05为纳入标准,P>0.10为剔除标准。结果：1、对良性前列腺增生症和前列腺癌的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本t检验,发现SOX9和NM23mRNA表达量在良性前列腺增生症和前列腺癌中的表达量有显著性差异(P<0.05), SOX9和NM23mRNA表达量在前列腺癌组织中比良性前列腺增生症组织中要高。2、对SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)在前列腺癌中不同的病理因素进行独立样本的t检验。发现在临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度的不同分组中SOX9和NM231mRNA表达量(Ct值)均有显著性差异(P<0.05)。SOX9mRNA表达量(Ct值)随临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度升高而升高。NM23mRNA表达量(Ct值)随随临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度升高而降低。3、对各临床病理因素分组不同的无进展生存期差异,进行log-rank检验,发现肿瘤恶性程度、Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值在单因素分析中是前列腺癌无进展生存期的影响因素。然后分别对Gleason评分、临床分期、肿瘤恶性程度和SOX9/NM23Ct值的不同分组绘制无进展生存曲线。在所有病例中,Gleason评分≤6分的病例无进展生存期长于Gleason评分>6分的病例(P<0.01,log-rank检验)。同样地,临床分期为Ⅰ-Ⅱ的比Ⅲ-Ⅳ的病例无进展生存期长(P<0.01,log-rank检验),肿瘤恶性程度分级为G1-G2的比G3的病例无进展生存期长(P<0.01, log-rank检验)。SOX9/NM23Ct小于2的比SOX9/NM23Ct值大于等于2分组的无进展生存期差异也有统计学意义(P<0.01, log-rank)。4、将单因素分析中有统计学意义的三项临床病理因素：Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值纳入Cox比例风险回归模型进行综合分析,变量筛选采用逐步向前回归法,以P<0.05为纳入标准,P>0.10为剔除标准。最终确定Gleason评分(P<0.01)和SOX9/NM23Ct值(P<0.01)是影响前列腺癌无进展生存期的主要因素。结论：1、良性前列腺增生症中前列腺组织的SOX9和NM23mRNA的表达值与前列腺癌中SOX9和NM23mRNA的表达值有显著差异,通过检测组织中SOX9和NM23mRNA的表达值可作为鉴别良性前列腺增生症和前列腺癌的指标。2、前列腺癌组织中SOX9和NM23mRNA的表达值随着Gleason评分,临床分期,肿瘤恶性程度的不同而显示出差异。SOX9mRNA表达值随着Gleason评分,临床分期和肿瘤恶性程度升高而表达增强。NM23mRNA的表达值随着Gleason评分,临床分期和肿瘤恶性程度升高而表达下降。SOX9和NM23基因表达值的比值可作为前列腺癌病人无进展生存期的临床指标。3. SOX9/NM23Ct值有助于判断前列腺癌的无进展生存期,其数值小于2提示无进展生存期较长,其数值大于等于2提示无进展生存期较短。
最后编辑于 2018-05-27 · 浏览 1.6 万
