[原创] 抗耐药肿瘤新药的研究

抗耐药肿瘤新药的研究

2．2．1取代芳基氧化吲哚类化合物的研究
除MDR逆转剂外，开发一些对MDR细胞无耐药性的新型抗肿瘤药物也是克服肿瘤耐药性的有效途径。我们在用当归芦荟丸治疗慢性粒细胞白血病取得疗效基础上，发现它的有效成分靛玉红(获国家发明三等奖)，以它为分子模板进行结构改造，设计了三类氧化吲哚化合物，从合成的几十个化合物中筛选出具有较高抗癌活性和较低毒性的PHⅡ-7，与靛玉红相比，它抗癌谱广，抗癌效果强，低毒高效。进一步研究发现PHⅡ-7及其衍生物不但对人各种肿瘤有效，而且对不同耐药的人肿瘤细胞具有同样疗效。
在PHⅡ-7的药理学研究中，发现PHⅡ-7的抗瘤谱广泛，对多种肿瘤细胞系都有杀伤作用;PHⅡ-7对动物移植肿瘤有明显抑制作用。体外细胞毒研究表明，PH-II7除对小鼠白血病L1210和P388细胞具有明显杀伤作用外，对10余种不同组织来源的人肿瘤细胞株，包括人白血病细胞株（CEM），人鼻咽癌细胞株（KB），人宫颈癌细胞株（HeLa）和胃腺癌细胞株（M803）等均有杀伤作用。IC50的范围为0.34~11.17mol/L。）。体内研究显示对多种动物移植肿瘤及人的KB细胞移植瘤均有抑制活性。最有价值的是无论在体内和体外研究，它对肿瘤耐药细胞包括人白血病细胞株K562/A02和HL60/ADR和人实体瘤MCF-7/ADR和KB/VCR与对相应的亲本细胞株K562,HL60,MCF-7和KB一样高效，对人肺癌耐顺铂的非MDR细胞株A549DDP和它的亲本细胞A549亦同样有效（表XX－5），表现出突出的抗耐药特性，这在国际上尚属少见。诱导细胞凋亡的研究也发现，在远大于IC50的剂量下，化疗药物阿霉素（对照品）诱导耐药性细胞凋亡数显著低于敏感细胞，说明了凋亡与耐药的关系；而PHⅡ-7剂量约为IC50值时，敏感及耐药细胞凋亡数无差别，同样在比阿霉素低10倍剂量下，PHII-7诱导HL60/A02凋亡同样都达50％以上，而阿霉素只够10％，表明PHⅡ-7不仅可诱导敏感细胞凋亡，也可诱导多药耐药肿瘤细胞的凋亡（图XX－15）。上述结果提示PHⅡ-7可能是具有新作用机制的抗癌新药。
体内试验采用在一只裸鼠身上左右两边同时

2．2．2番荔枝内酯类化合物的研究

自1982年Jolad等发现第一个番荔枝内酯化合物后，研究进展很快，至今已发现这类化合物达200多种。抗癌活性强的结构为邻双四氢呋喃类化合物。其中抗癌活性最强的是从Annonabullata树皮分离出来的bullatacin，据NCI对bullatacin的研究报道，研究了对于人的鼻烟癌9KB细胞株、人肺癌A549细胞株及结肠癌HT-29细胞株的作用，IC50分别为6.2×10-14，1.3×10-13，1.0×10-12μg/ml；L1210鼠白血病体内实验表明，bullatacin抗白血病作用是紫杉醇的300倍（按重量比计算）。是目前报道中体内外抗癌活性很强的化合物之一。番荔枝内酯类化合物的作用靶点为肿瘤细胞的线粒体。其机理为特异性地抑制肿瘤细胞的线粒体的NADH的还原酶或氧化酶，从而阻断电子的传递，减少ATP的生成，抑制线粒体的供能功能。符立梧等的研究结果表明bullatacin有较强的体外抗肿瘤活性。同时，以有MDR的细胞株与敏感细胞株（MCF-7/ADR与MCF-7，KBv200与KB）的IC50进行比较，均无显著性差别。提示MDR细胞株对bullatacin无耐药性。Pgp是一种依赖于ATP的外排泵，而番荔枝内酯的作用是阻断呼吸链的传递，使细胞内ATP迅速减少。番荔枝内酯对MDR肿瘤有效可能与其使MDR细胞内的ATP迅速降低从而使Pgp功能降低有关。符立梧以前的研究已证明，Fura-2/AM可被Pgp外排，使MDR细胞内的Fura-2（Fura-2/AM在细胞内酯解为Fura-2和AM）积累减少；Pgp的作用是依赖于ATP供能；而番荔枝内酯对肿瘤细胞的作用是减少ATP的生成，可影响Pgp的功能。因此，番荔枝内酯可能使Fura-2在MDR细胞内积累增加。这似乎可解释MDR细胞对番荔枝内酯不产生耐药的原因，是一种新的克服MDR机制；可望番荔枝内酯的开发为治疗MDR肿瘤的新型抗癌药。

2．  3基于单克隆抗体的生物疗法

肿瘤细胞发生耐药过程基本上是发生在细胞内。若药物攻击点或靶点不在细胞内而在细胞表面或甚至不在肿瘤细胞细胞本身从而避开上述细胞内MDR机制。从实验和初步临床资料来看，单克隆抗体是比较有希望的。这包括抗肿瘤细胞表面抗原的抗CD20的Rituxan , 抗HER2/neu 的 Herceptin ，针对Pgp的单克隆抗体和抑制肿瘤血管新生的VEGF受体KDR 的单克隆抗体。
单克隆抗体曾被誉为可用于治疗各种疾病的“魔弹”，现在已经成为现实。早期的单抗来自小鼠，它在体内的抗原性其失去治疗价值。现在随着基因工程抗体技术的开发，大多数单抗已经人源化，即用人肽序列取代了绝大部分小鼠单抗区段，使之与人免疫系统更加相容。目前全世界正在开发的单抗治疗剂约有80多种，其中有20多种已进入临床试验，大多数单抗治疗剂是针对着癌细胞。抗体以其针对指定抗原的高度特异性而逐渐成为肿瘤治疗的独特方法。临床研究结果确实是激动人心。现有的数据证实了单抗结合化疗、放疗、骨髓移植，甚至外科等较单用一种疗法的效果更佳，均有增强和协同作用。尤其是在一些复发性或难治性的耐药肿瘤病人中取得了较好的疗效。

2．3．1抗CD20抗体治疗淋巴瘤
97年11月，Genentech公司和IDEC Pharmaceutical公司获美国FDA批准在市场上销售RituxanTM，一种C2B8抗体，可用于治疗复发的、或难治低级的、或滤泡性的，CD20-阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤（NHL）。据在美国一项研究中，在166名化疗无效（耐药）患者中有80名患者肿瘤皱缩50%，或者在随后四周输注中，在10-12个月之间出现中值预期反应。Rituxan能与成熟的正常B细胞和B细胞肿瘤表面上的CD20抗原相结合，然后促使机体自然防御复原，以攻击和杀伤正常的和恶性的B细胞。骨髓中的干细胞缺乏CD20抗原，因此不会受此疗法的影响。在临床研究中，B-细胞数量在治疗结束后几个月内恢复到正常水平。Rituxan是10年来第一个用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的新治疗单抗，也是在美国第一个获准用于治疗癌症的单克隆抗体。此药剂比常规化疗具有更小的副作用，疗程更短，只需22天（而化疗则需4~6个月）。在后面进行的两项独立的研究中，200例复发性低级淋巴瘤病人经本品治疗后的反应率分别为46%和50%，但反应持久性较长（37例病人参加的研究的反应期平均为10.2个月，161例病人参加的研究的反应期超过11.8个月）。而对第2、3次复发的低级淋巴瘤病人进行抢救治疗时，传统药物环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松等一般只产生6个月左右的缓解作用。每隔1周短程输注本品4次，输注期间可有轻微的流感样症状和低血压发生，但致骨髓毒性很小。对于骨髓已受损害的复发性病人的再次治疗，本品因致骨髓毒性较小有利于联合治疗。在一项本品与环磷酰胺等传统药物联合治疗的研究中，复发性低级淋巴瘤病人的反应率为100%，平均缓解期超过20个月，缓解作用与bcl-2t（14；18）的血液和骨髓遗传异常的消除有关，多数复发性低级淋巴瘤病人有这种遗传畸变的特点，而治疗期间这种畸变消失。这种分子水平上的缓解暗示了治疗后缓解期的延长。这表明用抗体治疗耐药肿瘤是有效的。

2．3．2以肿瘤相关的血管新生为靶点抑制肿瘤的生长和转移的抗体
血管新生(angiogenesis)是一个受严格调控的多步骤过程,导致从已存在的脉管系统形成新的血管，对肿瘤的生长及转移,均是必需的。通过抑制新血管生成，中断肿瘤的营养供给，达到治疗目的，它代表了近年来一种治疗肿瘤及其它与病理性血管生成有关的人类疾病的新策略。
血管内皮生长因子(VEGF)作为内皮细胞特异性的促分裂原是其重要的正调节因子，其生物活性被两种高亲和力的酪氨酸激酶受体，即Flt-1（VEGF1）和KDR（VEGFR2）所介导。临床上包括实体瘤和血液系统肿瘤在内的大多数重要的人类肿瘤均有VEGF及其受体的过高表达。更为可喜的是，与传统治疗相比,VEGF和/或其受体的拮抗剂可能对肿瘤有较高的特异性,减少副作用,因避开肿瘤细胞耐药机制切断肿瘤细胞的血液供应会降低耐药的发生。近年来的研究表明，KDR/Flk-1受体由于数目少，表达于细胞表面等特点而更适于作为抑制血管新生的靶点。
目前，至少三种抗体作为抗血管新生治疗剂正处于积极地研究中，其中两个正进行临床试验以评价其抗肿瘤能力。RhuMAB VEGF是一种人源化的抗VEGF抗体正处于II/III期临床试验用于治疗肺癌、乳腺癌、前列腺癌和直肠结肠癌（Genentech，Inc.）。VitaxinTM是LM609的人源化形式，直接针对粘附分子v3，正进行III期临床试验治疗各种实体瘤(Ixsys,Inc.,San Diego,CA)。还要进行补充试验考察这两种抗体的安全性和耐受性，以确定其临床应用价值。第三种抗体，c-p1C11是一种针对KDR的IgG1型小鼠/人嵌合抗体，来源于从噬菌体显示文库中分离出的小鼠单链抗体。ELISA和FACS分别证实，c-p1C11能有效地与放射性标记的VEGF竞争性结合细胞表面的KDR，阻断VEGF和KDR的相互作用，BIAcore结合动力学分析显示，c-p1C11对KDR的亲和力与VEGF相似，但其解离速率却比VEGF慢3-5倍，表明c-p1C11有可能较长时间的和KDR保持紧密结合，有效地阻止VEGF与受体的结合和激活。c-p1C11还能有效阻止VEGF引起的KDR和MAP激酶p42/p44的磷酸化，抑制VEGF刺激的HUVEC的分裂。最后，尽管抗KDR抗体本身不能中和bFGF引起的HUVEC增殖，但能够大大抑制bFGF对VEGF促HUVEC增殖的协同作用。以一种移植人皮肤的SCID小鼠为模型，检测一种和c-p1C11体外特性相似的抗KDR的鼠源单抗Mab 6.64的抗血管新生作用，表明Mab 6.64能有效降低生长中的移植瘤的人血管密度。目前c-plC11已在1999下半年进入I期临床试验(ImClone Systems Incorporated, New York, NY)。

2．3．3治疗耐药肿瘤的微型双功能抗体（Diabody）
2．3．3．1双功能抗体的简介
双功能抗体（bispecific antibodies，BsAbs）是将肿瘤靶细胞抗原与效应细胞触发因子（如CD3抗原）连接起来，将被活化的淋巴细胞（如细胞毒性T淋巴细胞、CTL）定向导入肿瘤局部，以便更有效地杀伤肿瘤靶细胞，毒副作用小。近年来，在双功能抗体研究方面的一个重要进展，是利用双功能抗体将活化的T淋巴细胞导向表达靶抗原的肿瘤细胞，以发挥其对肿瘤细胞独特的杀灭或抑制作用。双功能抗体分为杂交型双抗、结合体型双抗、基因型双抗三种。Diabody就是研制最多的，通过基因工程技术产生的小分子的双价双特异性抗体片段，它具有较低的免疫原性，可以减少或避免重复应用双抗所引起的不良反应。
2．3．3．2双功能抗体的抗肿瘤机制
近年来，研究较多的是抗T细胞受体及抗肿瘤细胞膜抗原的双功能抗体，这种双抗可以诱导T细胞（主要是CTL）对肿瘤靶细胞的溶解或杀灭作用。
2．3．3．2．1靶细胞的溶解
特异性双抗能识别并连接肿瘤靶细胞和CTL，并能通过特异性触发CTL细胞表面的分子结构使CTL活化，活化的CTL释放细胞溶解颗粒，对肿瘤靶细胞产生溶解作用。这种特异性双抗能抑制T细胞的自然属性，将CTL转变为对靶细胞具有特异性杀伤作用的效应细胞。但是效应细胞必须与靶细胞通过双抗的桥接作用相连接后，才能引起靶细胞的溶解。目前资料表明，CTL介导的靶细胞溶解是通过活化的CT的排粒作用才得以实现。效应细胞在效应细胞-靶细胞界面，T细胞受体复合物（TCR）密集区域释放细胞毒性物质，对靶细胞产生杀伤作用。
2．3．3．2．2细胞因子释放
实验研究发现，着靶后的CTL能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长。某些人T细胞亚片段不能介导效应细胞（CTL）对靶细胞的溶解，但能抑制裸鼠体内肿瘤的生长，而且通过51Cr释放试验未发现周围肿瘤细胞被溶解，说明肿瘤生长的抑制与肿瘤细胞溶解没有直接关系。
由双抗连接效应细胞表面TCR分子结构后，可以诱导T细胞分泌一种物质进入细胞介质，从而抑制肿瘤细胞的生长。进一步研究证明，这种物质是干扰素-γ（IFN-γ）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α），它们均具有抑制细胞生长的能力。
在体内，着靶后的T细胞分泌的淋巴因子，能吸引并活化一系列其他种类的杀伤细胞，如NK细胞、巨噬细胞及中性粒细胞，它们均可作用于瘤细胞。而且，淋巴因子可以促进肿瘤细胞表面抗原决定簇的表达，例如MHC分子的表达，因此提高肿瘤细胞被自然发生的CTL所辨认，有利于对肿瘤细胞的杀伤。
双抗作为肿瘤靶向治疗有如下优越性：①在较低浓度下能有效地促进瘤细胞的溶解或杀伤；②能对抗竞争性人免疫性球蛋白IgG的抑制；③相对低水平的肿瘤相关抗原（TAA）表达足以诱发双抗对肿瘤细胞的溶解或杀伤；失去TAA表达的瘤细胞或不表达TAA的瘤细胞亦可为双抗所抑制或杀伤；④双抗所诱导释放的IFN-r可以相互诱生并活化其他抗肿瘤的效应细胞，如CTL、NK细胞、巨噬细胞等，并可产生一系列继发作用；⑤抗T细胞受体双抗可作为丝裂原，诱导静止状态的T细胞增殖；双抗与CTL结合后可增强IL-2诱导的T细胞增殖、淋巴因子释放及T细胞毒性；⑥可用于耐药性肿瘤的治疗。目前已应用于临床试验治疗的恶性肿瘤有乳腺癌、卵巢癌、小细胞肺癌、胰岛细胞癌和白血病等，可使患者病情减轻，生命延长。Kontermann RE构建了抗补体C1q和抗溶菌酶的diabody。体外试验证明，可富集C1q，导致溶菌酶包被的绵羊红细胞溶解。Holliger P等用抗免疫球蛋白的diabody聚集血浆中的免疫球蛋白，产生全抗体的效应因子功能，弥补了重组抗体缺乏恒定区的不足。这种diabody体外可聚集补体，引起单核吞噬细胞的呼吸爆发和溶解,并与CD8+的T淋巴细胞产生协同作用，导致大肠肉瘤细胞的裂解。Genetech公司研制的抗P185HER2/抗CD3的双功能抗体最近被美国FDA批准进入临床试验用于乳腺癌的治疗。总之，初步的研究证明，利用双功能抗体再导向效应细胞治疗肿瘤是目前很有前景的一种免疫疗法。

2．3．3．3抗Pgp、抗CD3微型双功能抗体

白血病复发是白血病难于根治的主要原因，也是目前治疗的难题之一，而很大部分复发白血病都有Pgp高表达，一些实体瘤的原发灶就有Pgp高表达外（内在性耐药），其他一些肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、头颈肿瘤等）转移灶常有Pgp高表达。因此早期检测和消除有Pgp表达的微小残留白血病耐药细胞和原发灶和转移灶有Pgp高表达的肿瘤细胞将有助于根治白血病和转移实体瘤。消除肿瘤残留和微小转移的新策略之一就是应用抗Pgp/CD3微型双功能抗体。采用抗Pgp/CD3微型双功能抗体的优点是：①特异交叉连接Pgp表达的耐药肿瘤细胞和CD3表达的T淋巴细胞并同时激活T淋巴细胞而杀伤肿瘤细胞；②它是利用机体自身免疫机制抑制肿瘤从而避免了使用外源非特异细胞毒物质；③国外临床试验已经证明双功能抗体之安全性，并观察到初步疗效。我们现已克隆到相应的抗Pgp单链抗体ScFv的基因和抗CD3的ScFv基因、测序和计算机模拟三维构象，拟在成功构建CD20/CD3微型双功能抗体并在体外和体内试验证明其有效性的基础上， 抗Pgp/抗CD3微型双功能抗体也有望通过动物试验推向临床。