【求助】做了近4个月WB了，一直做不出来，请各位指教

做了4个月WB了，可是一直没结果，连内参也做不出来。具体过程如下，请大家帮我看一下是哪里出问题了。
我要做的蛋白是93kd，来源于大鼠，内参是43kd。
实验过程：
1.蛋白提取（是膜蛋白）
用的是碧云天的RIPA裂解液(强)，产品编号是P0013B。蛋白酶抑制用的也是碧云天的PMSF（ST506）。
提取蛋白后用BCA法测了总蛋白。产品均没过期，提取方法是按说明书进行的。用酶免法测过目的蛋白含量，因此所提组织中应该是有目的蛋白的，而且做PCR也的其基因的表达。

2.蛋白变性（是提完蛋白后马上做的）
是用碧云天5*Loading buffer
按 总蛋白：Loading Buffer=1：4体积混合的，然后100℃ 5min（是按说明书来的）。

3.Western Blot
a.配胶
分离胶10% 浓缩胶5%
30%丙烯酰胺 5.0ml 1.0ml
1.5M Tris 3.8ml 1.0M Tris 0.75ml
10%SDS 0.15ml 0.06ml
H2O 5.9ml 4.1ml
10%APS 0.15ml 0.06ml
TEMED 0.01ml 0.006ml
总体积 15ML 5ML
封胶的时候用的是双蒸水，我一般是下午配胶，加浓缩胶、插好梳子后4℃ 过夜，第二天拿出来平衡30Min后拔梳子上样。玻璃板用双蒸水洗的，自然凉干，加胶也没有气泡。

b.电泳
我先加的电泳液再上的样。电泳液：3.03gTris+14.4g甘氨酸+1g SDS，加水200ML，然后定容至1L。样品在上样前100℃ 煮10min。用的恒压电泳，开始是70V，到分离胶后用的是100V，一直跑到底部结束。

c.电转
我用的是湿转，顺序是：白板（正极）、海绵、滤纸（2层）、NC膜、胶、滤纸、海绵、黑板（负极），板在电转槽放置也是正确的。电转液：3.03gTris+14.4g甘氨酸+200ml无水甲醇，加水定容至1L。恒流200mA 2.5小时。加NC膜时，每一层都赶了泡。

d.封闭
封闭液：2.5g脱脂奶粉+50ml 1*TTBS（1L的1*TBS+1ml TWEEN20）
封闭在室温下做了2个小时，时间是否够了？封闭液配方是对的吗？

e.结合一抗
一抗我用的是ABCAM公司的，编号ab22048，是鼠抗（mouse)，说明书上要求的终浓度是1-6ug/ml，我现在用的是6ug/ml。一抗稀释液和封闭液是一样的（是另配的）。我是在室温下孵育1h，然后压膜封口（里边没气泡）反贴法4℃过夜。第二天拿出来继续室温平衡30min。8min*6次洗膜，用TTBS洗的。内参用的中杉金桥的，编号TA-09，beta-actin。

f.结合二抗
二抗稀释液也是封闭液，说明书要求稀释5000-100000倍。我用的是5000倍。二抗在室温下3h，然后洗膜，洗膜同上。二抗是碱性磷酸酶标记（AP）的山羊抗大鼠。用的是中杉金桥的，ZB-2313，Ig（H+L）。

g.发光压片
用的是ECL发光法，发光液A：B=1：1混合，在加发光液之前NC膜是用水洗过的，并用滤纸吸水后加的，加时旁边用的是红色弱光，可以保证整张膜都被发光液浸过。然后吸取周边发光液后压片。此时肉眼根本看不到发光条带。
压片后进行显影、水冲洗、定影、冲片，具体显影、定影时间是按其说明书来的。

问题：
1.膜蛋白的提取用碧云天RIPA裂解液(强)有没有问题？
2.所提的蛋白样本变性后能否直接上样？是否需要加阴离子去污剂SDS后上样？如果是，这里的SDS是配胶时用的SDS吗？
3.封胶时用双蒸水是否可以？胶的配方有没有问题？10%的胶做93kd的蛋白应该没问题吧？
4.电泳液配方是否正确？电压设置是否有问题？
5.NC膜用的是0.22um孔径的，是不是有点小了？是否改用0.45um的？胶在电泳完后是否要在电转液中平衡30min才能用？还有NC膜是否也要平衡10min？电转时间和电流是否恰当？
6.电转完后，NC膜是用水漂洗还是用其他溶液，洗多久合适？电转液配方是否正确？封闭液配方是否正确？
7.一抗和二抗稀释液是否正确？洗膜液是否正确？一抗和二抗是否匹配？内参和二抗是否匹配？
8.一抗、二抗结合后洗膜时间是否长了，用TTBS洗是否正确？
9.用碱性磷酸酶标记的二抗是否不能用ECL法发光？还有用碱性磷酸酶标记的二抗做封闭是不是不能用脱脂奶粉？
以上都是我疑惑的地方，因为这个实验我做了好久，也查了不少资料，但总是找不出自己的问题出在哪儿。我现在不担心什么背景高啊，做的不漂亮啊等，我最急的是能把它做出来，至少也能把内参做出来，其他的都可以慢慢改进。还有我没发现的地方，请大家给我指点一下。另外，我做的蛋白含量很低，酶免测出的含量不到1ng/ml。总蛋白上样量是按80ug加的。