组织核蛋白提取步骤

组织样品核蛋白，实验室自己摸索方法有难度，还是选用商用的试剂盒。

MinuteTM新鲜/冷冻组织胞质胞核分离试剂盒

目录号：NT-032

描述：

从细胞和组织中分离细胞质和细胞核组分是一种常见的实验。细胞样品的组分分离相对简单直接，然而，

从组织样品中特别是冷冻组织中将胞质和胞核组分分离干净是很具挑战的。因为冷冻和反复冻融会引起组织

细胞结构的改变，加之不适当的匀浆方式和效率低的提取缓冲液，使得交叉污染十分严重。目前大多数商业

试剂盒设计可同时用于细胞和组织样品，但是忽略了两种类型样品之间的结构差异。因此，从新鲜 /冷冻组织

中分离胞质和胞核组分时，交叉污染问题无法避免 (见下文参考文献 1和 2)。这款新型的胞质和胞核分离试剂

盒专用于组织样品的胞质胞核分离，试剂盒特有的缓冲液体系和独特的操作方法可以将交叉污染降到最低。

整个操作可以在 30分钟内完成。

应用：

可应用于 SDS-PAGE immunoblottings ELISA IP，蛋白定位，凝胶迁移分析 2-D等其他应用。

试剂盒组分：

1.缓冲液A 25ml

2.缓冲液B 10ml

3. 缓冲液D 1.5ml

4. 缓冲液N 1.5ml

5.1.5ml离心管 40个

6.1.5ml研磨杵 2个

7.蛋白质提取粉 2克

运输：常温运输

储存：4度保存

重要产品信息：

1. 实验开始前将缓冲液A 和缓冲液B 冰上预冷。

2. 所有的离心步骤请使用4 度或冷冻离心机。

3. 使用前推荐将蛋白酶抑制剂加入分装的缓冲液A 中。

4. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制剂应在使用前加入分装的缓冲液A 和缓冲液B 中。

5. 推荐使用BCA 试剂盒用于蛋白浓度测定。

6. 当室温低于20 度时缓冲液D 中可能出现白色沉淀，使用前可将缓冲液D 在37 度水浴锅加热溶解沉淀。

操作方法：

1、 取20-30mg 新鲜或冷冻组织样品，放入试剂盒提供的1.5ml 离心管中，加入250ul 缓冲液A 覆盖组织，

冰上孵育5 分钟。使用提供的研磨杵轻轻的扭转研磨样品1 分钟（40-60 次）。研磨杵可以重复使用，

用清水清洁后，用纸巾擦干即可。

2、 14000 X g，离心5 分钟。转移200μl 上清液(胞质组分)到新的自备的离心管中保存。(如果上清液不够澄

清, 14000 X g，再离5 分钟进一步澄清)。如上所述用研磨杵再次把沉淀进一步研磨 (研磨60-100 次)。

研磨杵放置于管中，加入0.8 ml 缓冲液A 到管中。再研磨几次，拿出研磨杵。用1 毫升吸头上下吹打

15-20 次混匀。在冰上孵育5-8 分钟，让大的组织碎片通过重力作用沉到底部，将0.7 ml 的上清液转移

到一个新的试剂盒提供的1.5 ml 管中(尽量避免管底大的组织碎片)。

3、 500xg，离心2 min，弃去上清液。加入0.5 ml 的缓冲液B，涡旋振荡10-20 秒重悬沉淀。冰上孵育5 分

钟， 2000 X g 离心2 分钟，完全去除上清液。

4、 沉淀是分离的细胞核，根据不同的下游应用有两种核蛋白提取方式可选：

A .变性核蛋白提取（提取出的核蛋白适用于SDS-PAGE、Western blotting 等应用）

用50μl 缓冲液D 重悬沉淀(悬液可能粘稠，这是正常的)。称取50-60 毫克的蛋白提取粉，加入沉淀

(尽量避免接触管壁)。用研磨杵扭转研磨约60-100 次。研磨杵仍置于离心管中，加入50 -150ul 的缓

冲液A 到管中，再研磨几次(使用缓冲液A 的多少取决于沉淀的大小。研磨杵可以重复使用，用清水

清洁后，用纸巾擦干即可)。14000 X g，离心5 分钟。将上清液转移到一个新的自备离心管中(即是细

胞核蛋白)。可将蛋白酶抑制剂添加到核蛋白溶液中并储存于-20 或-80 度。蛋白质浓度一般为1-2mg/ml。

B .非变性核蛋白提取（提取出的核蛋白适用于ELISA、IP、酶活性测定、凝胶缓凝等应用）

用50μl 缓冲液N 重悬沉淀。室温孵育5 分钟。称取50-60 毫克蛋白提取粉加入沉淀(尽量避免接触

管壁)。用研磨杵扭转研磨约60-100 次。研磨杵仍置于离心管中，加入50 -150ul 的缓冲液A 到管中，

再研磨几次(使用缓冲液A 的多少取决于沉淀的大小)。10000 X g，离心5 分钟，将上清液转移到一个

新的自备的离心管中(即是细胞核蛋白)。可将蛋白酶抑制剂添加到核蛋白溶液中并储存于-20 或-80 度。

蛋白质浓度一般为0.5-1mg/ml。

关于胞质和胞核内参：

许多抗体在WB 中被用于检查组分分离的交叉污染。文献中常用的胞质内参包括但不限于GAPDH，

HSP90， LC3 A/B，tublin，HIF1，ESR1，ACTB 和Actin 等。我们推荐使用GAPDH，HSP90 或LC3 A/B,

不推荐β-actin， 因为Actin 也存在于细胞核(见参考文献3 和4)。核内参我们推荐LaminB1，LaminA/C，SC-

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