【原创】做小鼠肠道冰冻切片的一点体会

我最近在做小鼠肠道的一个基因的Trafficking，要求标本结构特别清楚漂亮，开始总是做得不是很满意，现在摸索出了一点经验，片子染色后做Confocal非常漂亮。和大家共享一下：

1. 杀死小鼠，取出一段空肠，用冰PBS液冲洗掉粪便等脏物；
2. 将肠段套在钝头注射器上，把头端用细线（就手术用的那种很细的肠线）栓紧，然后用小镊子轻柔的将肠腔翻转过来（这一步很关键！）注意不要损伤绒毛；
3. 放入2%PFA中4度2小时，或是4%PFA中4度1小时固定；
4. 用冰PBS洗两遍；
5. 放入30%蔗糖溶液（蔗糖溶于PBS，不是H2O）中，4度过夜，其中蔗糖溶液是肠道组织的8倍；
6. 次日将组织放入OCT中，4度缓慢震摇1-2小时；
7.包埋组织。这一步我试过很多方法，开始我是垂直包埋，我想这样可能切片可以见到整个肠腔，绒毛都向外张开，保证是纵切面可以看到绒毛的全貌，后来发现并非如此，因为组织很软，很难让它能确保垂直包埋进去。后来就直接平放进去然后切片时掌握角度也可以看到整个肠腔和绒毛的形态。

剪开包埋我也试过，我还试过做“瑞士卷”，就是剪开后反方向又卷成圆筒状包埋，但都不如现在的方法，因为剪开后又重新卷成圆筒状会损害绒毛组织。

当然如果是结肠就无所谓，不用翻转，怎么弄都漂亮。因为我的实验主要是要观察这个基因内化迁移的情况，对绒毛的要求比较高，要把微绒毛、terminal web 和肠上皮细胞的基底侧、apical侧都要显示的非常清楚。

关于如何冰冻切片我在这个版块学了很多，非常感谢！