【求助】有背景，没条带，大家帮我看看吧

我的目的蛋白有三个89KD的CD54，142KD的VE-Cadherin，260KD的VWF，做了几次DAB显色膜上有背景却不见条带。配制的胶为8%，有MARKER做参照，电泳260KD的MARKER出来后就停止了电泳；转膜用的是半干转，恒压18V，1h40min，结果MARKER 17~260KD都转到膜上了，GAPDH显色后条带清晰，可是目的条带的那部分膜却显不出条带，背景也深。一抗用的是新买的CST的，推荐用1:1000，我用的是1:800；二抗1:5000请问1,我是不是应该把一抗浓度在调大点比如1:500，以促进条带显出，同时降低二抗浓度以减弱背景（不知我的想法对不）；2，加一抗时，我可以三种抗体一起孵育吗？三者都是兔抗人的。3，我的一抗用5%BSA稀释，二抗用5%脱脂奶粉稀释，会不会有影响啊。

我时间不多了，希望大家帮我出出主意吧，先谢谢各位