【求助】请各位老师帮忙分析一下激光共聚焦图片是否正常，致谢

本人近期对一段组织（厚约1mm）做了一次共聚焦，因以前没做组织方面的经验，不知此图片中的背景是否正常，个人感觉背景有点深，但又不确定。请有此方面经验的老师帮忙分析一下，万分感谢。

具体操作如下：

1.4%多聚甲醛固定了四天（因初次预定的观察日期推迟致使多固定了几天）。

2.pbs-Tween洗5次x5min（所有清洗过程均在24孔板中进行， 每次用量为2ml）

3.二抗同源血清、1%BSA 0.5%Triton RT封闭1h

4.1%BSA 0.1%Triron PBS中 孵育一抗 湿盒 4度 过夜

5.0.1%Triton PBS-Tween 洗5次x10min

6.0.1%Triton TR标记的二抗 湿盒中 RT 1h

7.PBS-Tween 洗5次x10min

8. 防焠灭剂封片 4度保存 第二天共聚焦观察

一、二抗和防淬灭剂均来自scrus，浓度均为其推荐浓度。操作中戴手套、口罩，载玻片、盖玻片均泡过酸清洗。

另外，原本准备了三个标本，因第一次做没有经验，电镜室的老师找了将近一个小时才初步摸索好各种参数，第一个标本就花了2小时。此段时间，另外两个标本一直放于旁边备用，但当观察完第一个、再看第二个标本时，相同参数下却找不到任何荧光点，刚开始以为标本没做好，但换用第三个标本同样未发现任何荧光。当时我看到房间温度计显示20摄氏度，怀疑是温度所致，将标本置于冰箱中冷却后再次观察后果然成功观察到了目标物，但强度却明显低于第一个标本。镜下观察前所有标本一直避光，现在看来温度对荧光还是有一定影响的。所以想通过自身的教训提醒各位同道以后做共聚焦时别出现类似“事故”.....

好了，小弟在此期待着各位前辈对此图的评价。如果确是背景过深的话，请各位前辈提些建议。小弟在此谢过各位啦