我辛酸的western
你们好
小弟先行有礼了
我的western做法如下:
在6空板中用lipofectamine 2000转染细胞,我的是融合表达,目的基因带GFP,48小时后弃细胞上清,用PBS洗2次,控干,加入50ul三去污剂裂解液,加入相应的PMSF,冰上30分钟,吸液体到EP中,4度离心10分钟,吸上清放于-70度,备用。
取20ul加入6倍上样buffer和适量的DTT,煮10分钟,于冰上,用5%的积成胶,15%的分离胶,电泳。湿转,30V,过夜。
用20%的小牛血清封闭2小时,接着加入一抗于其中2小时,TTBS洗15*3,接着加入二抗(20%的小牛血清稀释)1小时,TTBS洗15*3,加入DAB显色,结果是在30KD处有一条带,连未转染的细胞也有。我的表达蛋白应该是55-60KD。
我用抗GFP的抗体再做,结果与第一次惊人的相似,未转的细胞依然有,请各位帮我想想办法。看我的结果问题在哪里。