【原创】我做WB的辛酸历程--从失败走向成功

直到今天我已然记不得自己提取过多少次总蛋白了。从最初的预实验到正式的实验，一次一次又一次，期间还更换过一次提取试剂。

其实，在开始做WB之前，我已经看了一些相关的实验理论和经验性文章。当时觉得自己看的东西还挺多，许多该明白的原理应该是懂了。但是，从来没有动手做过，心里多多少少还是有点发怵。所以，我第一次做WB，基本上是在实验室一个师姐的带领下走完了整个过程。那个师姐还是挺用心的，先给我做示范，然后让我自己动手做，期间还穿插了一些讲解，真的是很负责任。我对这第一次实验抱有很大希望，其实这个希望很简单，那就是能够看到目标蛋白的条带，如果做出来了，在我看来，这就是成功。可惜的是，那一次实验结果很悲惨，什么条带都看不到。后来那个师姐跟我说，没有关系的，很多人都遇到过这种情况。那个时候，我真的很懵，完全不知道问题出在哪里，都不知道应该从哪里着手分析，对于实验的关键环节完全没有概念。现在来看，我估计很可能是在切胶的时候，不小心把目的蛋白切掉了。当时我做的是内参蛋白，使用的是单克隆抗体，所以如果我切掉了目的蛋白，做不出条带是很正常的事情。

虽然没有做出来条带，但是我心里还是隐隐有一丝安慰。毕竟，我现在可以自己动手做WB了，心里不再感到发怵。第二次做WB，是我一个人完成的，当时不知道什么原因，在电泳的过程中，几个加样孔的蛋白跑着跑着就不在一个水平上了。我原本打算做两个蛋白的，一个内参，一个目的蛋白，这就必须要切胶（或者转膜以后再剪膜），可是几个孔的蛋白不在一个水平上，切胶（或剪膜）就很困难，不知道应该从哪里断。我想了想，那就降低要求吧，只做一个蛋白好了，我只想看一看，这次能不能做出条带，看看我的操作大体上是不是可行。为了保证万无一失，就是绝对不会把目的蛋白切掉，我几乎保留了整块胶（除了浓缩胶和溴酚蓝指示剂以下的部分），相对应的是，我也使用了一块奇大无比的PVDF膜，因为膜往往要比胶块更大。所以，后来孵育一抗和二抗的时候，我就用了一个很大的盒子。我的目的很简单，这是我第一次独立做WB，我想尽可能地把目的条带做出来，尽管这只是一个预实验，但是很重要，因为它至少可以检验，我是不是真的已经学会了WB的基本操作。因为足够的用心，这一次WB的条带真的做出来了，虽然条带不在一个水平上，但是清晰可见。我感到很开心。

但对于出现的问题，我依然疑惑不解，电泳的过程中，为什么蛋白跑着跑着就不在一个水平上了呢？后来，我把这个问题告诉了我的室友，我的室友说，他认识学校一位陈老师，据说这位陈老师的WB是整个学校做得最好的。这对于我来说，简直就是在迷茫的大海中突然找到了救命的稻草。很快我就联系上了这位陈老师，这是一位非常热情的老师，而且特别善良，又有耐心，她不厌其烦地回答了我问的每一个问题，还不止于此，她甚至建议我去她的实验室手把手地教我做WB，顺便帮我检验一下我的那些抗体是不是可用，抗体质量如果不过关，你再怎么做，也可能做不出条带。人的一生中，可能会遇到几个贵人，这样的人，并不会太多，在我看来，陈老师算得上是我的贵人了。接下来的几天，我开始在陈老师的实验室学习WB技术，其实主要是她在做，我在一边看，偶尔也有动手的机会，经过几天的学习以后，我对WB的整个操作步骤有了更加清晰的认识，对于一些细节可以更好地把握了。几个抗体也基本上鉴定完毕，条带都可以做出来，我放心了。陈老师对我说，很好，你可以出师了。

预实验到这个时候，基本上也算做完了。回到自己的实验室，要面对很多新的事情。包括动物选购，动物建模，动物组织取材，组织总蛋白和总RNA的提取等等一系列的事情，这又费了一些时间。按照之前的计划，我是准备先做mRNA比较的，也就是要先做实时荧光定量PCR，然后再做蛋白质的比较，也就是WB。后来，等我做完实时荧光定量PCR以后，我发现WB的很多操作步骤已经很模糊，自己独立做WB还有着难以想像的艰难。于是，我又不得不一次次地给陈老师发微信消息进行咨询，我问的问题很多，也很琐碎，有些问题，其实之前我问过的，但是真的忘记了，我不知道陈老师是不是记得她曾经回答过同样的问题，会不会认为我没有用心学习，这些我全然顾不上了，因为我真的忘记了，只能厚着脸皮再问一次，但无一例外地，这些问题陈老师都非常认真地解答了。可能陈老师意识到了我的无助吧，直到最后，陈老师建议说，要不，你还是过来我们这边做实验吧！我也觉得，自己现在的水平，还并不足以单独出师。于是，非常高兴地说，那好，我明天就过来做实验。

能够到陈老师的实验室做实验，那么操作步骤就不再是问题了。之前的预实验其实有很多个结论，其中一个重要结论就是，抗体可用。但这个时候新的问题又产生了。第一个问题，是蛋白质定量的问题，也就是如何最大程度地保证每个加样孔具有大致相等的总蛋白。第二个问题是，先前预实验HSF1和HSF5都是可以做出来的，但是到了正式实验，却做不出条带了。问题已经摆在眼前，怎么解决呢？第一个问题，似乎简单一些，但其实并没有想像的那么简单。有人会说，蛋白质定量有什么难的？可以测个浓度，然后根据浓度可以计算。但是96孔酶标板，真的没有那么准，孔与孔之间都会有差异，有一些差异甚至很大。这还只是其中一个因素，我们使用的标曲方程本身就是拟合而来的，它跟真正的直线方程肯定有所不同，使用这个方程计算浓度本身就是一种近似，不可能做到准确定量。总之，我用这个测浓度的方法做过几次定量，每次总有一两个孔与其他孔差异很大，如果说测量蛋白浓度真的可以准确定量，那么出现这样的结果就真的很费解了。既然测浓度的办法失效了，我得想其他办法来解决这个问题。当时，我正好学习到一个新技能，也就是根据各个孔的总蛋白量，计算出它们的归一化因子，利用这个归一化因子，就可以计算出相同质量的情况下，每个样品究竟需要多大的体积。最后，可以使用1X缓冲液把它们全部调配成相同浓度，相同体积的蛋白溶液。我本来信心满满的，我想这么厉害的软件，应该会很给力，可是，结果出来，我又傻眼了。总蛋白怎么还是不齐呢？对于一个新手而言，我能够想到的办法，都试过了，然而它们都失效了。最后，我跟陈老师说，陈老师，估计得靠您的经验了，我的办法宣告失败。后来在陈老师的帮助之下，这个定量的问题总算是解决了。

再说另一个新问题，先前预实验HSF1和HSF5都是可以做出来的，但是到了正式实验，怎么突然做不出来了呢？陈老师也觉得奇怪。于是，我想了各种可能的原因。第一，我们做预实验的时候，使用的样本来自wistar大鼠，而正式实验使用的样本来自SD大鼠。第二，我们的抗体是回收使用的，可能先前已经消耗了太多，以至于浓度太低，已经不能有效识别目的蛋白了。第三，我把大鼠的睾丸组织匀浆了保存的，还没有加PMSF，蛋白质发生了严重降解。第四，我提取总蛋白的过程中，发现一团像鼻涕一样的东西，试剂盒说明书上说，这团东西是不溶解的基因组DNA，如果目的蛋白跟基因组DNA结合紧密，要去超声一下，而我直接忽略了这个步骤，更要命的是，我直接把这团鼻涕舍弃了，陈老师告诉我说，这里有很多蛋白质。总而言之，就是有太多太多这种类似的不确定因素。我不知道是哪个因素导致了失败。最后，只有尽可能地把所有这些不确定的因素全部排除掉，再看看是什么情况。庆幸的是，每只大鼠两个睾丸，我当时只匀浆了一个，还有一个完整保存的，所以有了后悔的机会。那团像鼻涕一样的东西，经过超声以后，终于消失了。为了尽可能提高HSF1和HSF5做出来的机率，我们又加大了对应一抗的浓度。因为HSF1和HSF5的抗体都不是单克隆抗体，而我们之前的实验结果已经明确提示，它们都有很多杂带，于是，我果断地把这些杂带所在膜区域都剪掉了，让抗体专一一点，只能够找我们需要的目的蛋白。经过一番努力 ，最后HSF1和HSF5的条带终于做出来了。久违的HSF1和HSF5啊！我的内心真的有一种小小的成就感。今天本是阴雨天，但是我的心里却是晴天。我似乎又感受到了做科研的快乐，这样的感受在去年也有过一次。那个时候，我也在与我的EMSA死磕，也是失败了很多很多次，我以为我做不出来了。还记得那天，我也几乎做了一整天的实验，跑完琼脂糖凝胶电泳的时候，时间已经是晚上。那个时候整个人都很累，甚至可以说身心俱疲。但当我在紫外光下，看到条带的那一刻，我的眼前真的一亮，那可是期待已久的条带啊，条带有非常明显的梯度差异，说明随着蛋白质浓度的增大，被结合的DNA量也越多，从而说明这种结合就是特异性结合，我崩了很久的神经突然获得了释放，那种快乐妙不可言。

现在想一想，一路走来，真的非常不易，还经历过许许多多啼笑皆非的事情。比如我有一次用匀浆仪匀浆，结果在匀浆的过程中，破了两个管子，把别人的仪器弄得满是蛋白质溶液，这溶液里面可是加了PMSF的，我紧张得要命，赶紧给别人清理了。比如我有一次提前一天准备蛋白样品，说得好好的，第二天过来直接上样，结果却出现低级失误，导致第二天所有的工作又重头来过。比如我有一次，一边加样，一边跟老师聊着天，结果把蛋白样品，加到了Marker孔里。比如我有一次，提取总蛋白，要等RIPA溶解，等得很累了就跑去休息，定了闹钟，说好一个小时后起来接着做实验的，结果却一觉睡到了大天亮，睡眠质量真的很好，闹钟遇到我都会失效。但是，我想所有所有的经历，对于自己而言都是最宝贵的财富，无论是成功的，还是失败的，它们都实实在在地构成了我读研生活的一部分，而读研是我自己选择的，我想，既然如此，那就尽情地享受吧，享受失败，享受冲突，享受压力，享受挫折，享受失落，享受偶尔的收获，享受可能的迷茫，享受一切生活赐予我的礼物，因为我始终记得，这是我曾经梦寐以求的幸福！