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【求助】关于免疫共沉淀

消化内科医师 · 最后编辑于 2022-10-09 · IP 广东广东
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这个帖子发布于 16 年零 278 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位达人,我在园子里看了不少关于免疫共沉淀的帖子,现在自己要做了。但是不同的帖子其过程似乎有不同,这里我想把我的做法列一下,请各位指教,看正确否。
打算做A和B蛋白是否存在相互作用,激光共聚焦显示,荧光位置重叠。
1、重组A/B共表达的转染细胞。
2、PCR证实RNA水平A和B都有表达。
3、取10mm培养皿的重组细胞,用1ml NP40加PMSF和蛋白酶抑制剂列举细胞。
4、将裂解液离心,取上清。裂解液加入抗A的一抗,4度孵育2小时。
5、加入 Protein A/G PLUS-Agarose(Santa Cruz) 2Oul, 混合好,孵育过夜。
6、将混合液用PBS冲洗3次,5min/次,离心,去上清。
7、取剩下的悬状液体加入2×Lodding Buffer进行WB
8、WB的一抗孵育用抗B的单抗,然后看是否有B的条带出现。

现在我的问题是,用NP40裂解细胞,其裂解液好像很稠(NP40好像也是稠的,FLUKA的),不知道有没有问题。另外,Aarose混合液用PBS冲洗后还是用RIPA液冲洗?

请各位高人指点一下,明年就要毕业了。谢谢!












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