【交流】抗原修复方法

选择应用抗原修复技术一般用于经甲醛固定的石蜡切片标本中，经甲醛固定的部分组织细胞在进行免疫组化染色时其敏感性明显降低，其原因（1）（1）再用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定族；（2）甲醛在保存过程中会形成羧甲基，而封闭抗原决定族；（3）在用固定剂固定时，会使蛋白与蛋白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定族。因此，在染色时，有些抗原须经修复或暴露即将固定时分子之间所形成的交联破坏而恢复抗原的原有空间形态。
常用抗原修复方法：
1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法
（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源总时间控制在5－8分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。
③高压锅离开火源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
④为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。⑤缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
2．柠檬酸缓冲液微波抗原修复法
（1）适用范围：同方法1。
（2）仪器设备：微波炉、耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（＞500ml）于微波合中，微波加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档或中档继续微波处理15－20分钟，取出微波合冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①微波加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到微波结束总时间控制在15－20分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用耐高温塑料切片架，不能使用铜架或不锈钢。
③微波过程中，如果缓冲液蒸发而量减少，无法浸泡到组织片，应该适当加上一些蒸馏水，以保证组织片都能浸泡在缓冲液中，继续微波。
④微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
⑤为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
⑥缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3．柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法
（1）适用范围：同方法1，效果最差。
（2）仪器设备：电炉、烧杯（1000ml）、不锈钢或耐高温塑料切片架。（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于烧杯中，放在电炉上加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮沸20分钟，烧杯离开电炉后冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①煮沸时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到烧杯离开电炉总时间控制在20分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。
③微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
④为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
⑤缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
4．EDTA抗原热修复法——水浴法
（1）适用范围：同方法1。
（2）仪器设备：铝锅或铁锅、电炉、烧杯（1000ml）、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：1mM EDTA抗原修复液 pH8.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量1mM EDTA抗原修复液 pH8.0于烧杯中，放入铝锅或铁锅，盖上锅盖进行热煮（注意防止EDTA液从烧杯中倒出）直至锅中水沸腾（此时烧杯内的EDTA液不会沸腾）；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮沸20分钟，煮好后从锅中取出烧杯冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
②为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
③缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的EDTA缓冲液不能反复使用。
5．酶消化法抗原修复法（常用胰蛋白酶和胃蛋白酶）
（1）适用范围：同方法1，酶消化可以大大增强免疫组化染色效果。胰蛋白酶（trypsin）一般为0.05％～0.25％，常用0.125％。胃蛋白酶（pepsin）常用0.4％。
（2）操作步骤：
①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，；
②阻断内源性过氧化物酶（也可以在消化处理后进行阻断），用PBS（pH7.2－7.4）冲洗3次，每次3分钟。用吸水纸吸干组织周围的水分，界限笔沿组织外周划圈，再滴加酶消化，37℃15－20分钟（注意加酶前保持组织湿润，不能干，加酶后注意不要使液体流出圆圈外，酶消化时间可以根据情况调节），PBS冲洗3分钟×3次，进行组化的下一步。
（3）注意事项：配好的消化酶溶液至4－8℃冰箱保存，避免冰冻。