如何选择肠道菌群的研究手段（四）——宏蛋白组【肠菌研究方法系列讲解】

宏蛋白组

         宏蛋白组（Metaproteomics）是指特定时刻下，环境微生物所表达的所有蛋白。所研究种类非常多样化，比如活性淤泥中的微生物，海洋微生物，土壤中的微生物，发酵食品中的微生物，肠道微生物，粪便、黏膜腔等。

            宏蛋白组的定位是告诉我们肠道菌群正在干什么，如果从研究方法上看，宏蛋白组与蛋白组的研究方法完全相同，只是样本来源有所差异。所以下面以常见蛋白组的方案为例，讲一讲宏蛋白组是怎么研究的。

            蛋白组学主要运用了四种工具（数据库、软件、分离系统、鉴定系统），来分离、鉴定和定量所有的蛋白质：

•     分离：2D-SDS-PAGE或液相色谱（LC）

•     鉴定：蛋白数据库 + 质谱

•     定量：质谱 (iTRAQ与label free)

              下图是质谱定性的流程，从图中能深刻理解蛋白的鉴定原理：理论蛋白的质谱与实验测得的蛋白质谱做比对。

            蛋白组质谱定量主要有两种方法：iTRAQ与label free，下图是iTRAQ法的质谱定量的流程：蛋白提取—定量—酶解—鉴定—iTRAQ 肽段标记—LC-MS测定—数据分析。这里用到的同位素标记，然后进行了混样，如此做法的优点很多，这里也不详述，大家可自行学习。

           从这里开始我们初步接触到质谱。质谱手段在大数据的时代是非常有用的工具，它主要通过把样品中复合物进行分离、电离化使带上电荷，再测量离子的荷质比来测定物质的分子量（分子式），继而确定物质的名称。其基本原理：使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器得到质谱图，从而确定其质量。

           酶切后的肽段鉴定——二级质谱：肽段混合物通过一级质谱得到了一级谱图，然后从中选择一个肽段进行碰碎，得到碎片离子，再形成二级谱图。我们通过观察碎片离子的质量分布来推断肽段的残基组成，从而推测蛋白质的组成。如下图：

           上面还提到一个非常重要的理论质谱图，这里少不了一个蛋白数据库，还有一个预测工具。把原理做一下解释：某蛋白的一段氨基酸序列，其酶切位点是固定的，所以充分酶切后产生的多肽片段也是固定的，那么其二级质谱图也是固定的，存在质谱图库中，这所有工作都是用预测工具做出来的，并没有实际的实验操作，所以得到的是理论质谱图。蛋白序列数据库中最常用的是Uniport数据库。至于预测软件那就比较多了，如SEQUEST，Mascot；需要一定的生信基础。

           前面这些定性定量方法都搞清楚了，后面的差异分析就相对简单了，与前面的多样性与宏转录组学相近，有火山图、韦恩图、热图、以及KEGG电路图。

             在另一个帖子——《外泌体研究手段——蛋白组学》，对蛋白组学的原理、操作方法、数据分析方法等有详细的介绍，可补充学习。

              http://news.dxy.cn/bbs/thread/42260039

                就讲这么多了，如果想了解更多知识，可留言相互讨论。

         下一贴是肠菌研究方法的最后一贴了，宏代谢组学。

    如何选择肠道菌群的研究手段（五）——代谢组学 【肠菌研究方法系列讲解】