【求助】肝星状细胞原代培养

现正在做肝星状细胞的原代培养，方案如下
1。300gSD大鼠麻醉开腹门脉插管，用37度预热的250mlD-Hanks液+肝素20-30ml/min快速灌注清除肝内血液,1min，切下肝脏
2。1%胶原酶20毫升循环灌注，直至肝脏消化变软
3。肝脏剪碎用1%胶原酶孵育消化37度15分钟
4.100g十分钟，去沉淀
5.350g十分钟，取沉淀，DMEM悬浮，铺在25%percoll上（25%percoll预先30000g离心15分钟）800g离心30分钟，取培养液与percoll之间的细胞层
第一次分离细胞成功了，可最近几次都失败，特别是350g离心之后，沉淀中出现膜状物，没办法吹散，将其弃去后，就不剩什么细胞了，请问怎么回事？以上方法有什么可改进的地方吗？