（心得）ELISA trouble-shooting

做过一段时间的ELISA，总结了一些经验，供自己日后复习，也放在这里供大家参考。
症状：
1。阳性与阴性不能达到2.1的比值，阴性颜色太深    
2。阳性与阴性不能达到2.1的比值，阳性颜色太浅    
3。增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度  
4。增加一抗浓度，显色反应没有表现出应有的梯度    
5。加完TMB显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了  

可能问题：
1。阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中有某种成分与一抗作用
2。1）一抗效价不好
　2）抗原太稀
　3）封闭时间过长  
3。一抗与抗原的比例已经饱和
4。一抗与抗原的比例已经饱和
5。硫酸可能把其它成分都炭化了

解决办法：
1。纯化抗原除去干扰成分
2。1）换用一抗或增加一抗用量
　2）增加抗原浓度
　3）缩短封闭时间，封闭时间一般2小时以内即可
3。增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度
4。增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度
5。加少一点硫酸，参考值：50µlTMB+35µl硫酸

我认为一抗和封闭都是比较重要的步骤，如果ELISA还做不出满意的结果，可以从这两方面改进实验条件，能比较快地达到目的。