我的文章：基因芯片技术筛选骨肉瘤细胞差异表达基因
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利用基因芯片技术筛选不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因
摘要：目的 运用基因芯片技术研究骨肉瘤转移相关基因表达。方法 提取具有不同转移特性的骨肉瘤细胞总RNA，反转录制备杂交探针，应用基因芯片筛选与骨肉瘤转移相关的基因。杂交信号用ScanArray3000扫描，结果用ImaGene3.0软件分析。结果 对原位及转移骨肉瘤细胞基因表达谱分析，发现两种肿瘤细胞中存在差异表达基因，其中有抑癌基因、转移相关蛋白基因、细胞周期蛋白基因等，与肿瘤发生发展密切相关。结论 基因芯片技术对肿瘤转移机制研究有重要意义。
0 引言
基因芯片技术是近几年发展起来的一项新技术。它通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析，是探知基因在肿瘤与正常组织中表达差异、基因在不同组织和器官表达差异、基因在不同状态的细胞中表达差异等的重要手段[1～3]。本研究利用基因芯片技术筛选两种不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因，为后续的骨肉瘤转移相关基因等研究进行有益的探索。
1 材料和方法
1.1 芯片 表达谱芯片OTS－2.2D，购自上海博星基因芯片技术有限公司。cDNA芯片所用的512个靶基因cDNA克隆（主要为人肿瘤相关基因克隆）由上海博星公司和合作伙伴提供，以通用PCR引物扩增，PCR产物长度为1000～3000bp。
1.2 骨肉瘤细胞 骨肉瘤细胞选用本室建立的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607、高转移亚系SOSP-M[16]。用含10％新生牛血清的RPMI-1640( Gibco公司)培养，达1.0×107以后，分别收获细胞以备用。
1.3 提取RNA、逆转录、制备探针 用Gibco公司的Trizol试剂一步法加以改进抽提培养的SOSP-9607及SOSP-M总RNA。采用Oligotex mRNA Midi Kit(Quagen公司)分离纯化为mRNA。参照Schena方法逆转录标记cDNA探针并纯化[1,2]。在cDNA第一链合成中掺入荧光标记dUTP，用Cy3—dUTP标记SOSP-9607 mRNA，用Cy5—dUTF标记SOSP-M mRNA。探针乙醇沉淀后溶解在20ul 5×SSC十0.2％SDS杂交液中。
1.4 芯片杂交 基因芯片和杂交探针分别置于95℃水浴中变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15—17h。然后揭开盖玻片，分别用2×SSC十0.2％SDS，0.1％×SSC十0.2％SDS，0.1％×SSC洗涤10 min，室温晾干。
1.5 检测与分析 用ScanArray 3000扫描仪扫描芯片，得到的Cy3／Cy5图像文件通过划格确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值。用预先选定的内参照基因(40个管家基因)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。用ImaGene 3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。参照文献[1,2]方法设置判定基因有差异表达的标准：(1) Cy3和Cy5信号的比值的自然对数的绝对值＞0.69 (基因的表达变化在2倍以上)；(2) Cy3和Cy5信号值其中之一必须＞2000；(3) PCR结果良好。
2 结果
2.1 紫外分析及电泳检测显示获得高质量的总RNA。经过纯化，得到对照组（SOSP－9607）mRNA 5.15μg，OD260/OD280为2.229；实验组（SOSP-M）mRNA 3.76μg，OD260/OD280为2.280。
2.2 芯片杂交结果分析 芯片杂交所用的双探针分别SOSP-9607 mRNA、SOSP-M mRNA为模板合成，前者标以Cy3荧光素，后者标以Cy5荧光素。杂交结果见图1。X轴以Cy5荧光强度值(＝前景值－背景值)为坐标，Y轴以Cy3荧光强度值(＝前景值－背景值)为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为黄色，代表X值与Y值的比值在0.5至2.0之间，属非差异表达；数据点若为红色，代表X值与Y值的比值在0.5到2.0范围之外，有表达差异。
2.3 扫描图像 分别显示1次Cy3(图2A)和Cy5(图2B)标记的探针与芯片杂交的结果，白色点为超高表达而信号达饱和状态，其他点由红色向蓝黑色表示信号由强至弱。将Cy3和Cy5扫描图像完全重叠后，并赋以伪色成为双探针杂交的结果图（图2C）。其中红色表示高表达，绿色表示低表达，黄色表示水平无改变。
2.4 筛选数据 原始数据参照文献[1]作标准化处理：弃去Cy5、Cy3*值皆小于800的数据项，算出所有基因的Ratio值（Cy5/Cy3*）。筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据项共101项；在这101项数据的基础上，找出具有同一Gene ID号的成对差异基因，共11组22个数据项，列于表2。这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出一定的差异，且上下调趋势一致，程度相近。
3 讨论
目前认为，肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，实际是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。这些基因的主要功能是参与调控细胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命过程。当这些基因发生突变、重排、缺失、扩增而被异常激活或失活时，正常的受控增殖、分化或凋亡受到干扰，于是细胞无限增殖、分化受阻或寿命延长而形成肿瘤。要了解整个癌变过程中的基因改变，以至癌变的各个阶段中细胞全部基因表达的动态变化，需要研究的不是一个或几个基因，而是整个基因组在从正常到肿瘤的各个阶段中上千个基因表达的动态变化。利用基因表达谱数据可以随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式。
近年发展起来的基因芯片技术可直接检测mRNA的种类及丰富度，是研究基因表达的有力工具[1]。Wang等用类似技术分析与卵巢癌的发展有关的基因［3］。Wilson等用2种荧光染料分别标记药物处理前以及药物处理后的结核杆菌DNA，然后与包括结核杆菌97%开放阅读框架的DNA构成的微阵列杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析发现该药物诱导多个基因表达［4］。Livache等将HCV的5′UTR区及其型特异探针固定于硅芯片上，与不同标本DNA样品杂交，对其进行基因分型，结果表明该技术用于基因分型灵敏度很高［5］。
基因芯片技术近年逐渐应用于肿瘤转移研究。2001年，Chen等运用基因芯片比较不同侵袭能力肺癌细胞系得到差异表达基因，认为在肿瘤转移过程中，与细胞粘附、运动、血管生成、信号转导等有关的基因起着重要作用。还证明运用基因芯片和具有不同侵袭性的肿瘤细胞系“这种模型系统可以确定侵袭相关基因，使我们可以探究肿瘤转移过程中多个基因之间的复杂的相互作用”[6]。同年，Hegde用基因芯片比较三对结肠癌细胞系，认为176个基因表达有显著差异，值得进一步研究[7]。Yanagawa比较10例结直肠癌与其对应的转移病灶，分析认为有40个基因上调、7个基因下调。上调基因与细胞粘附、肌动蛋白细胞骨架重塑有关[8]。
骨肿瘤方面，2000年Scholl用基因芯片研究原位及转移横纹肌肉瘤细胞系，筛选发现许多基因变化，其中基质金属蛋白酶抑制剂基因下调，基质金属蛋白酶基因上调[9]；2001年Khanna用基因芯片技术筛选小鼠成骨肉瘤转移相关基因，得到53个差异表达基因。他根据功能将基因分为6类，在研究两种细胞生物学行为差异与基因表达差异之间的关系后认为，有10个基因（分属于细胞骨架、粘附、血管生成类）与骨肉瘤的转移关系密切[10]。此方面的研究，国内尚未见报道。
本实验利用基因芯片技术筛选两种具有不同转移能力的骨肉瘤细胞之间差异表达基因，结果发现在有显著差异表达的基因中，很多都与肿瘤的发生和发展过程有着密切的关系。在表l的上调基因为人类细胞周期蛋白基因，它与细胞周期有关，在细胞静止期低表达或不表达。其表达水平上调说明在发生转移的过程中，肿瘤的生长特性发生了显著变化。曾有报道细胞周期蛋白过度表达与淋巴结转移及临床肿瘤进展有关[11]。在下调的基因中，AF230904编码CIN85蛋白。该蛋白可能通过与原癌基因c-Cbl产物相互作用，在EGF受体介导的信号传导过程中起特殊的作用。X15187编码鼠肿瘤排斥抗原的人类同族体gp96。gp96表达量一般随肿瘤免疫原性增强而增加，参与MHC-I类抗原提呈。通过将肿瘤源性多肽运送到抗原提呈细胞的内抗原提呈通道，gp96可以激活免疫系统，进而减慢或终止肿瘤发展过程[12]。NM_00698编码人类膀胱癌相关蛋白，来自非侵袭性及侵袭性膀胱移行细胞癌差异筛选。该蛋白在膀胱癌的侵袭过程中被下调[13]。HUMBRCA1即人类乳腺癌易患基因，是1994年发现的一个抑癌基因，以常染色体显性遗传的方式传递。它所编码的蛋白质与一种和双链DNA损伤修复有关的称为RDAI蛋白质有关。另一个可能的功能是通过细胞周期依赖激酶抑制因子p21调节细胞周期。功能研究表明其参加了转录调节和DNA损伤修复，有认为其突变与p53突变有相关性。约70%BRCA1突变患者可检出p53突变。研究还提示这种抑癌基因在维持基因稳定性和调节细胞生长和分化中起作用[14]。HSU33849编码LPC，人类淋巴瘤原蛋白转换酶基因家族成员之一，在高分化淋巴瘤染色体易位断点处发现[15]。以上结果说明，骨肉瘤发生转移的过程中，有相当数量的基因表达水平发生了不同程度的变化。其中部分基因参与细胞生长和分化、细胞周期调节、信号转导过程等，其具体作用有待于深入研究。
本研究证明基因芯片技术应用于转移相关基因研究，可以方便快速地缩小研究范围，有效地筛选出目的基因进行深入研究，具有很好的可行性。
参考文献:
[1] Schena M, Shalon D, Dais RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J]. Science 1995;270(5235):467-470
[2] Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(20):10614-10619
[3] Wang K, Gan L, Jeffery E, Gayle M, Gown AM, Skelly M, Nelson PS, Ng WV, Schummer M, Hood L, Mulligan J. Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray[J]. Gene 1999;229(1-2):101-108
[4] Wilson M, DeRisi J, Kristensen HH, Imboden P, Rane S, Brown PO, Schoolnik GK. Exploring drug-induced alterations in gene expression in mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(22):12833-12838.
[5] Livache T, Fouque B, Roget A, Marchand J, Bidan G, Teoule R, Mathis G. Polypyrrole DNA chip on silicon device: example of hepatitis C Virus genotyping[J]. Anal Biochem 1998;255(2):188-194
[6] Chen JJ, Peck K, Hong TM, Yang SC, Sher YP, Shih JY, Wu R, Cheng JL, Roffler SR, Wu CW, Yang PC. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model[J]. Cancer Res 2001 Jul 1;61(13):5223-30
[7] Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray[J]. Cancer Res 2001 Nov 1;61(21):7792-7
[8] Yanagawa R, Furukawa Y, Tsunoda T, Kitahara O, Kameyama M, Murata K, Ishikawa O, Nakamura Y. Genome-wide screening of genes showing altered expression in liver metastases of human colorectal cancers by cDNA microarray[J]. Neoplasia 2001 Sep-Oct;3(5):395-401
[9] Scholl FA, Betts DR, Niggli FK, Schafer BW. Molecular features of a human rhabdomyosarcoma cell line with spontaneous metastatic progression[J]. Br J Cancer 2000 Mar;82(6):1239-45
[10] Khanna C, Khan J, Nguyen P, Prehn J, Caylor J, Yeung C, Trepel J, Meltzer P, Helman L. Metastasis-associated differences in gene expression in a murine model of osteosarcoma[J]. Cancer Res 2001 May 1;61(9):3750-9
[11] Fracchiolla NS, Pruneri G, Pignataro L, Carboni N, Capaccio P, Boletini A, Buffa R, Neri A. Molecular and immunohistochemical analysis of the bcl-1/cyclin D1 gene in laryngeal squamous cell carcinomas: correlation of protein expression with lymph node metastases and advanced clinical stage[J]. Cancer 1997 Mar 15;79(6):1114-1121
[12] Reed RC, Nicchitta CV. Chaperone-mediated cross-priming: a hitchhiker's guide to vesicle transport [review]. Int J Mol Med 2000;6(3):259-64
[13] Gromova I, Gromov P, Celis JE. Identification of true differentially expressed mRNAs in a pair of human bladder transitional cell carcinomas using an improved differential display procedure[J]. Electrophoresis 1999 Feb;20(2):241-8
[14] Zheng L, Li S, Boyer TG, Lee WH. Lessons learned from BRCA1 and BRCA2[J]. Oncogene 2000;19(53):6159-75
[15] Su X, He K, Niu C, Gu B, Cao Q, Chen Z, Chen S. Studies on complex chromosomal translocation and their relevance to clinical prognosis in acute promyelocytic leukemia[J]. Zhonghua Yixue Yichuan Xue Zazhi 1998 Aug;15(4):198-201
[16] Yang TT,Fan QY, Zhang DZ, Qiu XC. Establishing and characterizing a human osteosarcoma cell line (SOSP-9607)[J]. Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)1998;19(3):264
摘要：目的 运用基因芯片技术研究骨肉瘤转移相关基因表达。方法 提取具有不同转移特性的骨肉瘤细胞总RNA，反转录制备杂交探针，应用基因芯片筛选与骨肉瘤转移相关的基因。杂交信号用ScanArray3000扫描，结果用ImaGene3.0软件分析。结果 对原位及转移骨肉瘤细胞基因表达谱分析，发现两种肿瘤细胞中存在差异表达基因，其中有抑癌基因、转移相关蛋白基因、细胞周期蛋白基因等，与肿瘤发生发展密切相关。结论 基因芯片技术对肿瘤转移机制研究有重要意义。
0 引言
基因芯片技术是近几年发展起来的一项新技术。它通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，因而可以一次性对同一样品进行大量序列检测和核酸分析，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析，是探知基因在肿瘤与正常组织中表达差异、基因在不同组织和器官表达差异、基因在不同状态的细胞中表达差异等的重要手段[1～3]。本研究利用基因芯片技术筛选两种不同转移能力骨肉瘤细胞差异表达基因，为后续的骨肉瘤转移相关基因等研究进行有益的探索。
1 材料和方法
1.1 芯片 表达谱芯片OTS－2.2D，购自上海博星基因芯片技术有限公司。cDNA芯片所用的512个靶基因cDNA克隆（主要为人肿瘤相关基因克隆）由上海博星公司和合作伙伴提供，以通用PCR引物扩增，PCR产物长度为1000～3000bp。
1.2 骨肉瘤细胞 骨肉瘤细胞选用本室建立的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607、高转移亚系SOSP-M[16]。用含10％新生牛血清的RPMI-1640( Gibco公司)培养，达1.0×107以后，分别收获细胞以备用。
1.3 提取RNA、逆转录、制备探针 用Gibco公司的Trizol试剂一步法加以改进抽提培养的SOSP-9607及SOSP-M总RNA。采用Oligotex mRNA Midi Kit(Quagen公司)分离纯化为mRNA。参照Schena方法逆转录标记cDNA探针并纯化[1,2]。在cDNA第一链合成中掺入荧光标记dUTP，用Cy3—dUTP标记SOSP-9607 mRNA，用Cy5—dUTF标记SOSP-M mRNA。探针乙醇沉淀后溶解在20ul 5×SSC十0.2％SDS杂交液中。
1.4 芯片杂交 基因芯片和杂交探针分别置于95℃水浴中变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15—17h。然后揭开盖玻片，分别用2×SSC十0.2％SDS，0.1％×SSC十0.2％SDS，0.1％×SSC洗涤10 min，室温晾干。
1.5 检测与分析 用ScanArray 3000扫描仪扫描芯片，得到的Cy3／Cy5图像文件通过划格确定杂交点范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值。用预先选定的内参照基因(40个管家基因)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正。用ImaGene 3.0软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。参照文献[1,2]方法设置判定基因有差异表达的标准：(1) Cy3和Cy5信号的比值的自然对数的绝对值＞0.69 (基因的表达变化在2倍以上)；(2) Cy3和Cy5信号值其中之一必须＞2000；(3) PCR结果良好。
2 结果
2.1 紫外分析及电泳检测显示获得高质量的总RNA。经过纯化，得到对照组（SOSP－9607）mRNA 5.15μg，OD260/OD280为2.229；实验组（SOSP-M）mRNA 3.76μg，OD260/OD280为2.280。
2.2 芯片杂交结果分析 芯片杂交所用的双探针分别SOSP-9607 mRNA、SOSP-M mRNA为模板合成，前者标以Cy3荧光素，后者标以Cy5荧光素。杂交结果见图1。X轴以Cy5荧光强度值(＝前景值－背景值)为坐标，Y轴以Cy3荧光强度值(＝前景值－背景值)为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为黄色，代表X值与Y值的比值在0.5至2.0之间，属非差异表达；数据点若为红色，代表X值与Y值的比值在0.5到2.0范围之外，有表达差异。
2.3 扫描图像 分别显示1次Cy3(图2A)和Cy5(图2B)标记的探针与芯片杂交的结果，白色点为超高表达而信号达饱和状态，其他点由红色向蓝黑色表示信号由强至弱。将Cy3和Cy5扫描图像完全重叠后，并赋以伪色成为双探针杂交的结果图（图2C）。其中红色表示高表达，绿色表示低表达，黄色表示水平无改变。
2.4 筛选数据 原始数据参照文献[1]作标准化处理：弃去Cy5、Cy3*值皆小于800的数据项，算出所有基因的Ratio值（Cy5/Cy3*）。筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据项共101项；在这101项数据的基础上，找出具有同一Gene ID号的成对差异基因，共11组22个数据项，列于表2。这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出一定的差异，且上下调趋势一致，程度相近。
3 讨论
目前认为，肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，实际是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。这些基因的主要功能是参与调控细胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命过程。当这些基因发生突变、重排、缺失、扩增而被异常激活或失活时，正常的受控增殖、分化或凋亡受到干扰，于是细胞无限增殖、分化受阻或寿命延长而形成肿瘤。要了解整个癌变过程中的基因改变，以至癌变的各个阶段中细胞全部基因表达的动态变化，需要研究的不是一个或几个基因，而是整个基因组在从正常到肿瘤的各个阶段中上千个基因表达的动态变化。利用基因表达谱数据可以随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式。
近年发展起来的基因芯片技术可直接检测mRNA的种类及丰富度，是研究基因表达的有力工具[1]。Wang等用类似技术分析与卵巢癌的发展有关的基因［3］。Wilson等用2种荧光染料分别标记药物处理前以及药物处理后的结核杆菌DNA，然后与包括结核杆菌97%开放阅读框架的DNA构成的微阵列杂交，通过不同颜色的荧光信号强度分析发现该药物诱导多个基因表达［4］。Livache等将HCV的5′UTR区及其型特异探针固定于硅芯片上，与不同标本DNA样品杂交，对其进行基因分型，结果表明该技术用于基因分型灵敏度很高［5］。
基因芯片技术近年逐渐应用于肿瘤转移研究。2001年，Chen等运用基因芯片比较不同侵袭能力肺癌细胞系得到差异表达基因，认为在肿瘤转移过程中，与细胞粘附、运动、血管生成、信号转导等有关的基因起着重要作用。还证明运用基因芯片和具有不同侵袭性的肿瘤细胞系“这种模型系统可以确定侵袭相关基因，使我们可以探究肿瘤转移过程中多个基因之间的复杂的相互作用”[6]。同年，Hegde用基因芯片比较三对结肠癌细胞系，认为176个基因表达有显著差异，值得进一步研究[7]。Yanagawa比较10例结直肠癌与其对应的转移病灶，分析认为有40个基因上调、7个基因下调。上调基因与细胞粘附、肌动蛋白细胞骨架重塑有关[8]。
骨肿瘤方面，2000年Scholl用基因芯片研究原位及转移横纹肌肉瘤细胞系，筛选发现许多基因变化，其中基质金属蛋白酶抑制剂基因下调，基质金属蛋白酶基因上调[9]；2001年Khanna用基因芯片技术筛选小鼠成骨肉瘤转移相关基因，得到53个差异表达基因。他根据功能将基因分为6类，在研究两种细胞生物学行为差异与基因表达差异之间的关系后认为，有10个基因（分属于细胞骨架、粘附、血管生成类）与骨肉瘤的转移关系密切[10]。此方面的研究，国内尚未见报道。
本实验利用基因芯片技术筛选两种具有不同转移能力的骨肉瘤细胞之间差异表达基因，结果发现在有显著差异表达的基因中，很多都与肿瘤的发生和发展过程有着密切的关系。在表l的上调基因为人类细胞周期蛋白基因，它与细胞周期有关，在细胞静止期低表达或不表达。其表达水平上调说明在发生转移的过程中，肿瘤的生长特性发生了显著变化。曾有报道细胞周期蛋白过度表达与淋巴结转移及临床肿瘤进展有关[11]。在下调的基因中，AF230904编码CIN85蛋白。该蛋白可能通过与原癌基因c-Cbl产物相互作用，在EGF受体介导的信号传导过程中起特殊的作用。X15187编码鼠肿瘤排斥抗原的人类同族体gp96。gp96表达量一般随肿瘤免疫原性增强而增加，参与MHC-I类抗原提呈。通过将肿瘤源性多肽运送到抗原提呈细胞的内抗原提呈通道，gp96可以激活免疫系统，进而减慢或终止肿瘤发展过程[12]。NM_00698编码人类膀胱癌相关蛋白，来自非侵袭性及侵袭性膀胱移行细胞癌差异筛选。该蛋白在膀胱癌的侵袭过程中被下调[13]。HUMBRCA1即人类乳腺癌易患基因，是1994年发现的一个抑癌基因，以常染色体显性遗传的方式传递。它所编码的蛋白质与一种和双链DNA损伤修复有关的称为RDAI蛋白质有关。另一个可能的功能是通过细胞周期依赖激酶抑制因子p21调节细胞周期。功能研究表明其参加了转录调节和DNA损伤修复，有认为其突变与p53突变有相关性。约70%BRCA1突变患者可检出p53突变。研究还提示这种抑癌基因在维持基因稳定性和调节细胞生长和分化中起作用[14]。HSU33849编码LPC，人类淋巴瘤原蛋白转换酶基因家族成员之一，在高分化淋巴瘤染色体易位断点处发现[15]。以上结果说明，骨肉瘤发生转移的过程中，有相当数量的基因表达水平发生了不同程度的变化。其中部分基因参与细胞生长和分化、细胞周期调节、信号转导过程等，其具体作用有待于深入研究。
本研究证明基因芯片技术应用于转移相关基因研究，可以方便快速地缩小研究范围，有效地筛选出目的基因进行深入研究，具有很好的可行性。
参考文献:
[1] Schena M, Shalon D, Dais RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J]. Science 1995;270(5235):467-470
[2] Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(20):10614-10619
[3] Wang K, Gan L, Jeffery E, Gayle M, Gown AM, Skelly M, Nelson PS, Ng WV, Schummer M, Hood L, Mulligan J. Monitoring gene expression profile changes in ovarian carcinomas using cDNA microarray[J]. Gene 1999;229(1-2):101-108
[4] Wilson M, DeRisi J, Kristensen HH, Imboden P, Rane S, Brown PO, Schoolnik GK. Exploring drug-induced alterations in gene expression in mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(22):12833-12838.
[5] Livache T, Fouque B, Roget A, Marchand J, Bidan G, Teoule R, Mathis G. Polypyrrole DNA chip on silicon device: example of hepatitis C Virus genotyping[J]. Anal Biochem 1998;255(2):188-194
[6] Chen JJ, Peck K, Hong TM, Yang SC, Sher YP, Shih JY, Wu R, Cheng JL, Roffler SR, Wu CW, Yang PC. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model[J]. Cancer Res 2001 Jul 1;61(13):5223-30
[7] Hegde P, Qi R, Gaspard R, Abernathy K, Dharap S, Earle-Hughes J, Gay C, Nwokekeh NU, Chen T, Saeed AI, Sharov V, Lee NH, Yeatman TJ, Quackenbush J. Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray[J]. Cancer Res 2001 Nov 1;61(21):7792-7
[8] Yanagawa R, Furukawa Y, Tsunoda T, Kitahara O, Kameyama M, Murata K, Ishikawa O, Nakamura Y. Genome-wide screening of genes showing altered expression in liver metastases of human colorectal cancers by cDNA microarray[J]. Neoplasia 2001 Sep-Oct;3(5):395-401
[9] Scholl FA, Betts DR, Niggli FK, Schafer BW. Molecular features of a human rhabdomyosarcoma cell line with spontaneous metastatic progression[J]. Br J Cancer 2000 Mar;82(6):1239-45
[10] Khanna C, Khan J, Nguyen P, Prehn J, Caylor J, Yeung C, Trepel J, Meltzer P, Helman L. Metastasis-associated differences in gene expression in a murine model of osteosarcoma[J]. Cancer Res 2001 May 1;61(9):3750-9
[11] Fracchiolla NS, Pruneri G, Pignataro L, Carboni N, Capaccio P, Boletini A, Buffa R, Neri A. Molecular and immunohistochemical analysis of the bcl-1/cyclin D1 gene in laryngeal squamous cell carcinomas: correlation of protein expression with lymph node metastases and advanced clinical stage[J]. Cancer 1997 Mar 15;79(6):1114-1121
[12] Reed RC, Nicchitta CV. Chaperone-mediated cross-priming: a hitchhiker's guide to vesicle transport [review]. Int J Mol Med 2000;6(3):259-64
[13] Gromova I, Gromov P, Celis JE. Identification of true differentially expressed mRNAs in a pair of human bladder transitional cell carcinomas using an improved differential display procedure[J]. Electrophoresis 1999 Feb;20(2):241-8
[14] Zheng L, Li S, Boyer TG, Lee WH. Lessons learned from BRCA1 and BRCA2[J]. Oncogene 2000;19(53):6159-75
[15] Su X, He K, Niu C, Gu B, Cao Q, Chen Z, Chen S. Studies on complex chromosomal translocation and their relevance to clinical prognosis in acute promyelocytic leukemia[J]. Zhonghua Yixue Yichuan Xue Zazhi 1998 Aug;15(4):198-201
[16] Yang TT,Fan QY, Zhang DZ, Qiu XC. Establishing and characterizing a human osteosarcoma cell line (SOSP-9607)[J]. Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)1998;19(3):264
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