【求助】请教关于细胞器分离方面的技术
这个帖子发布于 18 年零 350 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
本人正在进行CHO细胞分离线粒体、内质网、高尔基体等细胞器的实验。
实验步骤如下：收集约1.8X108个细胞，用1XPBS洗涤1次后，加入TE(PH8.0)1.8毫升混匀后用匀浆器匀浆，苔盼蓝染色见绝大部分细胞膜破裂后，4℃1000g离心10分钟，取离心后上清2.1毫升，加入1.54M蔗糖9.9毫升，混匀变成12毫升1.28M混合液，依次向上加入1.13M、1.05M、0.96M、0.81M蔗糖各6毫升，置于Beckman Optima LE-80K超速离心机(用SW28水平转头)26000rpm(平均离心力约8.9万g)离心2小时，结果发现分层不是很明显，在0.81M上面、0.81M /0.96M界面、0.96M/ 1.05M界面、1.05M /1.13M界面隐约有白色云雾状物，管底也有少许沉淀。
吸取白色云雾状物及管底沉淀物，分别用线粒体抗体(COX、anti-porin)、内质网抗体(anti-PDI)、高尔基体抗体(anti-Syntaxin)进行Western Blot，结果发现分离出的细胞器纯度较差，如管底沉淀物中既能杂到内质网的信号，也能杂到线粒体的信号。
不知我上述实验操作过程中有无不妥当之处?不知大家有没有较为成熟的细胞器分离方面的技术资料，请赐教，谢谢!
本人Email ：wanjinchen75@yahoo.com.cn
实验步骤如下：收集约1.8X108个细胞，用1XPBS洗涤1次后，加入TE(PH8.0)1.8毫升混匀后用匀浆器匀浆，苔盼蓝染色见绝大部分细胞膜破裂后，4℃1000g离心10分钟，取离心后上清2.1毫升，加入1.54M蔗糖9.9毫升，混匀变成12毫升1.28M混合液，依次向上加入1.13M、1.05M、0.96M、0.81M蔗糖各6毫升，置于Beckman Optima LE-80K超速离心机(用SW28水平转头)26000rpm(平均离心力约8.9万g)离心2小时，结果发现分层不是很明显，在0.81M上面、0.81M /0.96M界面、0.96M/ 1.05M界面、1.05M /1.13M界面隐约有白色云雾状物，管底也有少许沉淀。
吸取白色云雾状物及管底沉淀物，分别用线粒体抗体(COX、anti-porin)、内质网抗体(anti-PDI)、高尔基体抗体(anti-Syntaxin)进行Western Blot，结果发现分离出的细胞器纯度较差，如管底沉淀物中既能杂到内质网的信号，也能杂到线粒体的信号。
不知我上述实验操作过程中有无不妥当之处?不知大家有没有较为成熟的细胞器分离方面的技术资料，请赐教，谢谢!
本人Email ：wanjinchen75@yahoo.com.cn
