介绍brdu标记方法

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介绍brdu标记方法原理.方案.应用

细胞增殖标记物Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广。

在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g体重，分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠，应用抗Brdu抗体，ICC染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射Brdu后，计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu，计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。
掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。
盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复染色程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。