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[求助]请教免疫共沉淀的问题

最后编辑于 2022-10-09 · IP 上海上海
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这个帖子发布于 19 年零 180 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好,我最近在做两个膜蛋白的相互作用,看它们的二聚化,用免疫共沉淀这种方法,得到了很奇怪的结果,请大家帮我分析一下是什么原因?我在这两个受体上分别接了cmyc 和HA,然后用cmyc抗体去IP,HA抗体去做western blot的一抗,具体的步骤如下:
1.收集的细胞用PBS洗2次(on ice)
2.均匀加入300ul裂解液,置冰上20min
3.细胞刮下至dorf管中,4℃ 13000rpm×10min
4.转移上清液至新的dorf管中,每管先吸出20ul+20ul 2×sample buffer,混匀后置-20℃,检验用
5.每管加1ul cmyc抗体, 4℃ 3h
6.保存的Beads混匀后吸出10000×5sed,吸出上清加裂解液吹匀(比例是1:1)
7.beads吹匀后每管30ul加入,4℃过夜
8.离心10sed,吸出上清,加入1ml裂解液洗3次,最后用1mlPBS洗一次,吸净
9.40ul/well, 1×sample buffer(无DTT,不煮沸),煮1min后,run gel.
以下步骤同western blot

做了好久,都是出现这样的情况,见图,从左至右是带表达带cmyc tag的受体,带HA tag的受体,共表达两种tag的受体。每次都出现很明显的三条带,而且非常一致,感觉都是假阳性的结果,不知道是我哪个部分出现了问题?
bow!
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