[求助]请教免疫共沉淀的问题
1.收集的细胞用PBS洗2次(on ice)
2.均匀加入300ul裂解液,置冰上20min
3.细胞刮下至dorf管中,4℃ 13000rpm×10min
4.转移上清液至新的dorf管中,每管先吸出20ul+20ul 2×sample buffer,混匀后置-20℃,检验用
5.每管加1ul cmyc抗体, 4℃ 3h
6.保存的Beads混匀后吸出10000×5sed,吸出上清加裂解液吹匀(比例是1:1)
7.beads吹匀后每管30ul加入,4℃过夜
8.离心10sed,吸出上清,加入1ml裂解液洗3次,最后用1mlPBS洗一次,吸净
9.40ul/well, 1×sample buffer(无DTT,不煮沸),煮1min后,run gel.
以下步骤同western blot
做了好久,都是出现这样的情况,见图,从左至右是带表达带cmyc tag的受体,带HA tag的受体,共表达两种tag的受体。每次都出现很明显的三条带,而且非常一致,感觉都是假阳性的结果,不知道是我哪个部分出现了问题?
bow!
