[求助]关于ASA－PCR的问题

突变位点放在3’端，3'第二位也设计了一个错配。无论我怎么调整PCR条件，退火温度已经高达72度，镁离子浓度低至1.25mM，野生型和突变型引物都能拉出条带来。试了几个基因组DNA样本情况还是这样。是不是引物设计上需要再调整呢？有人说用8％DMSO可以提高特异性，我也试了，但是没效果。我设计的野生型和突变型引物gc含量比较高，60％多，片段比较短，150bp。另外我检测的是C/T的突变，第二位引入的错配是强错配A-G。请高手指点一二，不甚感激！